槐杞黄对哮喘大鼠BALF中IL-5及INF-γ的影响

张琴珍，尚云晓

支气管哮喘是以气道高反应性和嗜酸性粒细胞性气道炎症为特征的免疫紊乱性疾病。众多研究表明，Th1/Th2功能失衡、Th2细胞优势分化是导致哮喘发病的重要机制之一［1］。IL-5是由Th2细胞分泌的细胞因子，它促进嗜酸性粒细胞的产生和在气道的聚集。Th1细胞分泌INF-γ等细胞因子，抑制哮喘反应。目前，支气管哮喘的治疗主要依靠抗炎和解痉，而针对免疫发病机制的治疗较为薄弱。槐杞黄为临床辅助治疗儿童支气管哮喘的免疫调节药物，本实验通过给予哮喘动物模型不同的干预措施，测定Th1、Th2细胞因子水平，比较不同干预效果，以期为儿童哮喘的临床治疗提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 卵蛋白(美国Sigma公司)，百日咳灭活菌苗(北京生物制品研究所)，醋酸地塞米松片(天津药业有限公司)，槐杞黄(启东盖天力药业有限公司)，ELISA试剂盒(美国GBD公司)。

1.2 实验动物 雌性Wistar大鼠40只，SPF级，体质量(140±10)g，由中国医科大学中心实验室动物部提供，饲养条件一致。

1.3 分组和模型制备

1.3.1 动物分组 随机分成4组:正常对照组(N)、哮喘模型组(A)、地塞米松组(DXM)、地塞米松组+槐杞黄组(H)，每组10只。按不同的影响因素分别进行研究。饲养期间给予正常饮食。

1.3.2 大鼠哮喘模型的制作［2］除N组外，于第1、7天，各组大鼠腹腔注射1%卵蛋白1 mg、1%氢氧化铝凝胶及6×109/mL百日咳灭活菌苗致敏液共1 mL，共致敏2次。第15天开始雾化吸入2%卵蛋白诱喘。每日30 min，连续7 d。N组大鼠以生理盐水代替激发液进行处理。

1.3.3 给药 自第15天起连续7 d，激发前30 min，各组灌胃给药(均配成3 mL)。N组:生理盐水3 mL;A组:生理盐水3 mL;D组:地塞米松1 mg/kg，3 mL;H组:地塞米松1 mg/kg+槐杞黄8 g/kg，3 mL。

1.4 取材 于末次激发后24 h内取材。以10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后，固定于解剖板，75%酒精消毒，打开胸腔和颈部。心尖取血，静置2 h，3 000 r/min 4℃离心10 min，取上清 －80℃保存待测细胞因子。支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(Eos)计数:①止血钳夹闭气管上端和右肺主支气管;②灌洗支气管和左侧肺:用密闭式静脉留置针插入气管上端，0.5 mL PBS反复冲洗，共4次，共回收到1.7 mL以上灌洗液，回收率超过85%;③灌洗液4℃、1 500 r/min离心10 min;④回收上清，－80℃保存待检细胞因子;⑤用1 mL含有1%BSA的PBS重悬细胞沉淀，取10 μL重悬液进行细胞计数。余液再次4℃离心，参数同上;⑥离心后去上清，滴入1滴血清，轻吹散细胞，涂片3张;⑦涂片瑞氏-吉姆萨染色，细胞分类计数，于光学显微镜下进行细胞分类，至少数300个细胞每视野，至少进行4个视野的细胞计数。算出嗜酸细胞的百分比，用细胞总数乘以百分比，即得出嗜酸细胞的绝对值。

1.5 ELISA检测各组大鼠血清OVA特异性IgE、BALF中 IL-5、INF-γ 严格按照试剂盒(美国GBD公司)要求操作，试剂盒的检测最低限为1 ng/mL。IL-5、INF-γ操作步骤按试剂盒要求进行。拟合标准曲线，得到直线方程后，根据各样品孔OD值推算出样品中IL-5、INF-γ含量(pg/mL)。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，ANOVE Tukey检验比较各组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察 经OVA激发后，模型组小鼠出现烦躁不安、呼吸增快、咳嗽、腹肌收缩、弓背向上、抓挠口鼻、反应迟钝、二便失禁等症状，严重者可见呼吸急促，呼吸节律不整，口唇紫绀;长期激发可见体质量减轻，毛色失去光泽，精神状态差。给药组和阳性对照组上述症状可获得不同程度的缓解。

2.2 对血清各项指标的影响 对血清中OVAIgE、BALF中IL-5含量和细胞总数(×106/mL)及Eos%的影响:上述各指标A组较N组显著增高(P＜0.05);D组和H组较哮喘模型组有所改善(P＜0.05);H组较D组进一步下降(P＜0.05);与N组相比，H组OVA-IgE、IL-5含量和Eos%基本降至正常水平，差异无统计学意义(P＞0.05)。BALF中 INF-γ的水平:A组低于 N组(P＜0.05);D组和H组各指标较A组回升(P＜0.05);H组较D组进一步回升(P＜0.05)，与N组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 不同干预对血清各项指标的影响(±s)

表1 不同干预对血清各项指标的影响(±s)

注:与正常组比较，*P＜0.05;与哮喘组比较，#P＜0.05

组别 只 OVA-IgE IL-5 INF-γ 细胞总数 Eos(%)P N 10 172.29±2.98 22.87±6.26 80.19±8.82 1.17±0.34 0.89±0.49 ＜0.05#10 436.40±2.77 54.94±10.32 55.83±10.08 2.91±0.62 20.85±17.49 ＜0.05*D 10 268.56±4.83 43.63±7.96 63.10±5.75 2.07±0.63 11.55±7.73 ＜0.05*#H 10 179.22±3.98 27.61±5.24 74.43±7.60 1.52±0.53 2.52±4.40 ＜0.05#*A

3 讨论

大量研究表明，支气管哮喘的发病过程中存在Th2细胞的过度分化和Th2细胞因子的过度分泌，是气道炎症启动和维持的关键因素。在哮喘的发病机制中，细胞因子不仅在慢性气道炎症中起着重要作用，在很大程度上还决定着Th细胞的分化趋势。有研究表明，Th类型的主要依据为Th0在受到外界抗原刺激后，主要分泌哪类细胞因子，而调控和决定细胞因子产生的关键取决于哪类转录因子占主导，STAT4/STAT6、T-bet/GATA-3两组转录因子在Th0分化中起关键作用［3］。IL-5的异常分泌与转录因子 Sp1、E12/E47、Oct-2、c/EBPbeta、GATA-3和酪氨酸激酶JAK2、JAK1等表达异常有关［4-5］。Th2细胞主要分泌包括 IL-5在内的一系列细胞因子。IL-5是Eos的存活发育因子，可刺激骨髓Eos增生，并促使Eos从骨髓到外周血再向气道募集，是较强的Eos增殖和趋化因子。IL-5还可促使Eos活化，并诱导Eos释放阳离子蛋白等毒性蛋白颗粒，产生过氧化物阴离子等增多。另外，IL-5还可以通过抑制Eos凋亡而增强其存活力，从而导致哮喘的嗜酸性粒细胞性气道炎症［6］。Th1细胞主要分泌包括INF-γ在内的一系列细胞因子。INF-γ在支气管哮喘中起保护作用，其分泌减少与哮喘的发生关系密切［7］。众多研究表明，纠正Th1/Th2功能失衡，可以减轻支气管哮喘的症状［8］。槐杞黄由中药槐耳、枸杞和黄精等成分组成。体外研究表明，中药槐耳可通过多种途径对T淋巴细胞紊乱进行调节［9］。笔者通过比较干预前后各种细胞因子水平，证实哮喘大鼠模型存在嗜酸性粒细胞大量聚集的气道炎症、Th2优势分化和Th2细胞因子过度分泌的Th1/Th2功能失衡。通过地塞米松的治疗，上述情况可以得到一定程度的缓解，而加用槐杞黄则可使上述情况基本恢复至正常水平。本实验仅初步验证了槐杞黄可调节Th1/Th2功能失衡，其具体机制尚待进一步的研究。

［1］ Wegmann M.Th2 cells as targets for therapeutic intervention in allergic bronchial asthma［J］.Expert Rev Mol Diagn，2009，9(1):85-91.

［2］ Leung SY，Eynott P，Nath P.Effect of ciclesonide and fluticasone propionate on allergen-induced airway inflammation and remodeling features［J］.J Allergy clin Immunol，2005，115(5):989-996.

［3］ Ahlfors H，Limaye A，Elo LL.SATB1 dictates expression of multiple genes including IL-5 involved in human T helper cell differentiation［J］.Blood，2010，116(9):1443-1453.

［4］ Takatsu K，Kouro T，Nagai Y.Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response［J］.Adv Immunol，2009，101:191-236.

［5］ Nakamura Y，Ghaffar O，Olivenstein R，et al.Gene expression of the GATA-3 transcription factor is increased in atopic asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，1999，103(2 Pt 1):215-222.

［6］ Kim SH，Lee YC.Piperine inhibits eosinophil infiltration and airway hyperresponsiveness by suppressing T cell activity and Th2 cytokine production in the ovalbumin-induced asthma model［J］.J Pharm Pharmacol，2009，61(3):353-359.

［7］ Kandelaki ET，Nemsadze KP，Chkhaidze IG.INF-gamma during respiratory-syncytial induced obstructive respiratory syndrome in infection in children under one year of age［J］.Georgian Med News，2005(129):69-73.

［8］ Yuan L，Wu L，Chen J.Paclitaxel acts as an adjuvant to promote both Th1 and Th2 immune responses induced by ovalbumin in mice［J］.Vaccin，2010，28(27):4402-4410.

［9］ 俞建.槐耳对哮喘缓解期儿童T淋巴细胞调控失衡的影响［N］.第八届亚太儿科变态反应、呼吸和免疫学会(APAPARI)年会.2009.