基于Overlap PCR方法进行猪伪狂犬病毒TK基因缺失载体的构建、鉴定及生物学分析

毕研丽 ，郭广君 ，，吕素芳 ，魏 凤 ，，沈志强 ，

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

伪狂犬病病毒（PRV）是引起多种家畜和野生动物以发热、流产和死亡、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种疱疹病毒，对养猪业已造成了巨大的经济损失。基因组为线状双股DNA，核酸长度约150 kb，病毒基因组是由长独特区（UL）、短独特区（US）以及US两侧的末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）所组成[1]。国内外对PRV分子生物学方面的研究越来越深入，其中TK是PRV的非必需基因和主要毒力基因，它与病毒在机体中的潜伏感染和在神经组织中的增殖有关[2]。TK基因已知与病毒烈性感染后建立神经潜伏性感染有关，而TK基因部分缺失的PRV病毒尽管在细胞水平上其复制能力变化不大，但对5～6周龄的仔猪毒力则大大降低[3]。因此，TK基因是PRV减毒疫苗株构建的一个理想靶标。

Overlap PCR是利用PCR技术的原理，将两段含有重叠序列的片段连接起来的一种PCR衍生技术。在Overlap PCR反应中，两个片段相互重叠配对的区域作为双链模版，以没有配对的非重叠区域作为引物，向两侧延伸补平到单链区末端，即可获得包含两个片段序列的全长PCR产物。Overlap PCR技术作为一种简单快速的技术手段，在定点缺失突变实验中得到了广泛应用[4-5]。本研究应用Overlap PCR技术扩增PRV SA株的TK基因，构建转移重组载体质粒，为研制以PRV为载体的活载体多价基因工程疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、载体和转化菌

PRV SA 株、pBluescript SK（+）载体、大肠杆菌DH5α、BHK细胞均由本院重点实验室保存；PMD18-T载体购自宝生物（大连）有限公司。

1.2 试剂及工具酶

逆转录酶 M-MLV、LA Taq 酶、dNTP、2×GC buffer、HindⅢ、BamHⅠ等限制酶和T4 DNA连接酶购自宝生物（大连）有限公司；DNA回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；低熔点琼脂糖购自Sigma；其它细胞培养试剂购自Hyclone公司。

1.3 引物的设计

为了使TK同源臂足够长从而提高同源重组的效率，我们将同源臂分别向上和向下延伸至TK基因上游和下游的UL26和gH区，设计引物分别进行扩增，所用引物如表1所示。

?

1.4 RNA的提取及TK基因的扩增

按照QIAGEN公司的RNA提取试剂盒说明参考，所有器皿和试剂均经0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液去RNase处理。考虑到PRV基因组GC含量高的特性，我们采用Takara公司的LA Taq高保真酶和专门用于扩增高GC含量DNA模版的GC buffer来进行扩增。第一步PCR反应扩增两个同源臂的反应体系为：2×GC buffer 12.5 μL，dNTP 2 μL，上游下游引物各0.5 μL，PRV基因组DNA 2 μL，LA Taq 聚合酶 0.5 μL，补水到 25 μL。反应循环条件为：95℃1 min；68℃1 min；72℃1 min共35个循环。在反应前可以把反应混合物（聚合酶除外）于99℃预变性5 min。

用凝胶回收试剂盒将两个同源臂PCR扩增片段产物回收后，即可进行第二步的Overlap PCR。反应体系为：2×GC buffer 12.5 μL，dNTP 2 μL，回收同源臂片段（10倍稀释）各1 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，补水到24 μL，（这里我们先不加引物让两个片段相互重叠延伸补平）反应条件为：95℃1 min；70℃30 s；72℃2 min 3个循环，然后95℃1 min；65℃30 s；72℃2 min 3个循环，最后95℃1 min；60℃30 s；72℃2 min 4个循环，这时我们补加TK-L-F和TK-R-R两个引物各0.5 μL，达到总体积25 μL，再进行常规PCR反应，反应条件为：95℃45 s；70℃30 s；72 ℃ 2 min 10 个循环然后 95 ℃ 45 s；68 ℃ 30 s；72℃2 min 25个循环。经过回收，酶切，连接克隆载体PMD18-T vector，送宝生物（大连）公司测序。

1.5 TK转移重组载体的构建及鉴定

将质粒pMD-TK和真核表达载体pBluescript SK（+）用BamHI和HindⅢ分别酶切，对双酶切后带有BamHI和HindⅢ酶切位点的目的片断和pBluescript SK（+）用凝胶回收试剂盒回收。用T4 DNA连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，提取质粒，经PCR和酶切鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒pBTK送往大连宝生物工程有限公司测序。

1.6 体外转染重组质粒与PRV基因组

按照LipofectamineTM2000产品说明书，通过脂质体介导法用重组表达质粒pBTK和PRV SA基因组共转染培养良好的单层BHK-21细胞，以正常生长的BHK-21细胞为非转染空白对照组。观察转染细胞病变形成情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变，初步判断重组病毒拯救成功。将感染重组病毒的细胞用胰酶消化后，利用PBS洗涤3次，4000 rmp离心弃上清。提取细胞DNA，PCR检测目的基因。

1.7 空斑纯化

将出现细胞病变的共转染产物反复冻融3次，10-2～10-7稀释，分别取400 μL接种至长满单层的BHK细胞上，37℃吸附1 h，吸弃培养液，用无钙镁的PBS洗涤3次，每孔覆盖低熔点琼脂糖2.5 mL，37℃CO2培养箱中培养观察，待空斑形成后，用0.01%中性红溶液染色，37℃作用2 h，挑取空斑接于长满单层细胞的24孔板中，观察病变，收毒，-20℃保存。对阳性株进行连续传代，观察突变株的遗传稳定性，计算TCID50毒价。

1.8 重组病毒遗传稳定性检测

将初次筛选获得的初代pBTK重组病毒在BHK细胞上连续传代，提取阳性细胞的基因组DNA，PCR检测目的基因，同时设空载体细胞及未转染的BHK细胞作为阴性对照。

2 结果

2.1 TK基因PCR扩增

凝胶电泳显示TKL、TKR基因的PCR扩增产物条带分别为886 bp、911 bp，与预期结果符合。经过这一步的PCR，我们成功获得了两个同源臂片段（图1）。经过Overlap PCR，我们成功扩增出了长度1814 bp的目的片段（图2）。

2.2 重组载体pBTK的构建

将重组质粒pBTK进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳后，获得的片断与预期大小一致；pBTK载体经HindⅢ/BamHI酶切获得一条约为1814 bp的片断（图3，4）。测序结果显示，TK基因的读码框正确，表明TK基因已成功插入到pBTK载体中。

2.3 体外转染与空斑筛选结果

通过脂质体介导法，以构建好的质粒pBTK与PRV基因组共转染BHK细胞，待病变后收取细胞液。各取100 μL接于长满单层的24孔细胞培养板，出现病变后收毒。分别取200 μL制备病毒模板，经PCR筛选阳性株（图5）。将检测为阳性的共转染产物反复冻融3次，梯度稀释后分别取400 μL接于长满单层的6孔细胞培养板，做空斑筛选。挑取空斑接于长满单层的24孔板中，病变后收毒。取200 μL制成模板进行PCR筛选，选取阳性株如此重复筛选直至阳性率达100%为止。将阳性突变株接种BHK细胞，接种后24 h观察，病变后收毒，连续传代12次后，细胞病变稳定，测得TCID50毒价是5.75，表明构建的双基因缺失突变株毒价减弱且遗传稳定。

2.4 TK基因的遗传稳定性检测

筛选出的第 1、2、5、8、10、15 代整合的 BHK 细胞均可扩增出1814 bp大小相符的条带，而所设同批次对照没有扩增出条带（图6）。

3 讨论

疫苗接种是防制伪狂犬病的重要手段之一。常规疫苗在接种后虽然能预防临床症状的出现，但不能防止强毒在被感染动物体内复制、排毒。基因缺失疫苗在PRV根除计划中占重要作用，在美国和各欧共体成员国及中国台湾地区推广的伪狂犬根除计划中，以及目前的商品化基因缺失疫苗中，TK基因和GE基因的缺失被认为是安全和有效的[6-7]。TK基因缺失疫苗是最早的基因工程缺失疫苗，已成为商品疫苗。世界上第一个获得批准使用的基因工程致弱活疫苗就是伪狂犬的TK 缺失疫苗株BUK-d13[8-10]。该TK株在细胞培养上，即使在含有HAT的选择条件下，也不能回复为TK+，对小鼠、鸡、兔和绵羊的毒力和亲神经性与BUK相比大大降低，对猪不仅无毒力而且有较好的免疫原性。TK基因缺失后的病毒同野毒株一样在培养细胞上增殖良好，但毒力和潜伏感染的能力大大降低。研究发现，其构建的TK缺失重组病毒与SA株在PK-15上形成的空斑大小进行了比较，结果发现两者无明显差别，这与陈焕春等实验结果一致[11]。

伪狂犬病毒基因缺失疫苗重组病毒株构建的经典方法可分为三个步骤：首先构建要缺失基因的一左一右两个同源臂，缺失即在这一步引入，将同源臂连接到转移载体上；第二步，通过将PRV基因组DNA和含有同源臂的转移载体共转染PRV易感细胞，通过细胞内的同源重组，同源臂和原始病毒基因组对应片段互换，即产生基因特定缺失的重组病毒；最后通过扩增和空斑筛选，即可获得含有缺失的重组病毒。其中第一个步骤，构建缺失转移载体步骤是最基本也是最重要的一步，选取哪一段基因用于缺失和同源臂构建不仅会影响第二步的同源重组的效率，也决定了缺失重组病毒疫苗株的免疫效果。

最早的构建同源臂的方法是利用病毒基因组DNA上本身含有的特异性限制性内切酶酶切位点，用选定的内切酶进行酶切，即可获得所需要的基因组片段即同源臂。这种方法需要提取大量的病毒基因组DNA用来酶切，且所需要的同源臂基因组片段不一定正好含有可利用的特定酶切位点，因此实际应用具有很大的局限性。PCR方法的出现为同源臂的构建提供了新的思路：通过设计特异性的引物，可以把选定的病毒基因片段即同源臂扩增出来，将两个同源臂片段依次插入克隆载体中，即可获得转移载体[12-13]。但这样的技术路线实际应用中也会遇到同源臂片段中含有酶切位点与克隆用酶切位点冲突的情况，这时候就必须通过定点突变将同源臂中发生冲突的核苷酸位点置换，才能进行克隆连接。正是基于此问题的存在，我们利用重叠延伸PCR的技术手段对原来采用的方法进行一些改进。

由于PRV基因组DNA为150 kb，G+C含量达73%以上，局部G+C含量高达97%，复杂的二级结构经常影响PCR扩增，对测序反应也提出了更高的要求。本研究通过采用不同条件，如退火温度、聚合酶的选择、循环数、冰上配制反应体系、热启动等，最终高保真的扩增出TK基因。研究结果表明，两同源臂在TK基因中相距750bp，重组病毒在BHK-21细胞传15代后，PCR检测其缺失不变。TK 基因缺失后的突变株同野毒株PRV Sa株一样在培养细胞上增殖良好，遗传稳定，噬斑大小无明显区别，但致细胞病变能力有所降低，TCID50毒价下降至5.75。下一步将利用小鼠等进行动物实验来进一步研究，为研制以PRV为载体的活载体多价基因工程疫苗奠定基础。

[1]Marchioli C C，Yancey R J Jr，Wardley R C，et al.A vaccine strain of pseudorabies virus with deletions in the thymidine kinase and glycoprotein X genes[J].Am JVetRes， 1987， 48（11）：1577-1583.

[2]Lisa E，Pomeranz A，Shley E，et al.Molecular Biology of Pseudorabies Virus：Impact on Neurovirology and Veterinary Medicine[J].Microbiol Mol Biol Rev，2005，69（3）：462-500.

[3]Jacobs L，Rziha H J，Kimman T G，et al.Deleting valine-125 and cysteine-126 in glycoprotein gIofpseudorabiesvirusstrain NIA-3 decreasesplaque size and reduces virulence in mice[J].Arch Virol，1993，131（3-4）：251-264.

[4]Quint W，Gielkens A，Van Van Oirschot J，et al.Construction and Characterization ofDeletion Mutants of Pseudorabies Virus:a New Generation of ‘Live’Vaccines[J].J Gen Virol，1987，68：523-534.

[5]Song Y F，Jin M L，Zhang S L，et al.Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type 2[J].Vet Microbiol，2007，119（1）：97-104.

[6]Jacobs L， Rziha H J， Kimman T G，et al.Glycoprotein Iofpseudorabiesvirus（Aujeszky's disease virus）determines virulence and facilitates penetration of the virus into the central nervous system of pigs[J].Acta Vet Hung，1994，42（2-3）：289-300

[7]Kinker D R，Swenson S L，Wu L L，et al，E-valuation of serological tests for the detection of pseudorabies gE antibodies during early infection[J].Vet Microbiol.1997，55（1-4）：99-106.

[8]Kit S，Kit M，Pirtle E C.Attenuated properties of thymidine kinase-negative （TK-）pseudorabies virus to challenge infection with virulent virus[J].Comp Immunol Microbiol Infect Res，1985，23（1）：15-26.

[9]Willeberg P，Leontides L，Ewald C，et al.Effect of vaccination against Aujeszky’s disease compared with test and slaughter programme：epidemiologicaland economicalevaluations [J].Acta Vet Scand Suppl，1996，90：25-51.

[10]Nauwynck H，Glorieux S，Favoreel H，et al.Cell biological and molecular characteristics of pseudorabies virus infections in cell cultures and in pigs with emphasis on the respiratory tract[J].Vet Res，2007，38（2）：229-241.

[11]陈焕春，周复春，方六荣，等.伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-、LacZ-+突变株的构建 [J].病毒学报，2001，17（1）：69-74.

[12]郭广君，吕素芳，沈志强，等.山东省分离强毒株猪伪狂犬病病毒SA株TK基因结构与进化分析[J].黑龙江畜牧兽医，2009（8）：76-79.

[13]Heckman K L，Pease L R.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension[J].Nature Protocols，2007，2：924-932.