门源县泉湾养鸡场新城疫抗体水平监测

童海龙

（青海省门源县青石嘴兽医站，青海 门源 810301）

本次检测对门源县某鸡场已经过新城疫免疫的鸡群进行新城疫抗体水平监测。该鸡场有零星散发的鸡只死亡的情况出现，通过病理表现及（HA）实验检疫，所发病鸡为新城疫感染，考虑到该场已作过新城疫免疫接种，采用（HI）实验详细了解该场新城疫抗体水平，并作出相应处理措施以进一步深入防止新城疫病毒的入侵。

1 材料

1.1 试验仪器

注射器、玻棒、96孔微量板、微量加样枪、恒温水浴箱、冰箱、针头、试管、微型震荡器、离心机。

1.2 试验试剂

生理盐水、枸橼酸钠抗凝剂、任氏液、1%的鸡红细胞。

1.3 诊断抗原

新城疫病毒。

2 方法

2.1 血液样品的处理

在养鸡场随机采血样60份，对其进行编号，保存于10℃左右，在3天之内，将血样以3000 r/min离心10min，将上层的血清吸入干净的离心管中，置于4℃下保存。

2.2 枸橼酸钠抗凝剂的制备

先称取柠檬酸钠3.8 g粉末，加入100mL蒸馏水定容，装瓶，121℃高压灭菌15min，得到的抗凝剂浓度为3.8%。

2.3 单位抗原的配制

先从冰箱中取出保存的冻干的浓缩抗原，将其放在室温条件下待完全溶化。与2mL蒸馏水稀释溶化后，通过血凝试验测其抗原效价，以能引起100%血凝的病毒最高稀释度作为抗原的效价，此稀释度为1个HA单位抗原。例如血凝终点滴度为1:512，则4个单位的稀释度为1:128，将1mL抗原加入127mL生理盐水，即为4单位抗原[3]。

2.4 配制1%的红细胞悬浮液

随机选取3只成年公鸡，从颈静脉采血，总共采100mL，并将其迅速加入含有枸橼酸钠抗凝剂的空容量瓶中，轻轻振荡使血液与枸橼酸钠充分混匀。取10mL血液和90mL生理盐水共同加入一个大离心管中进行3000 r/min的离心处理5分钟，离心完之后将其上清液倒去，以上操作重复3至4次。操作完毕之后，用10μL量程的微量加样枪吸取5μL的红细胞加入495μL的生理盐水中，充分混匀，就制成了1%的红细胞悬浮液。

2.5 血凝和血凝抑制试验方法（HA是测抗原水平，HI测被检样品的抗体水平）

采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验，利用血凝素（HA）蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象，用来检测禽血清中的免疫抗体，在进行HI试验之前必须进行HA试验，以确定HI试验中所用抗原HA滴度[2]。

结果判定标准 以100%抑制凝集的血清最大稀释孔以该血清的滴度，即血清效价（HI）。免疫后的HI效价≥5log2为阳性，判定为免疫合格；HI效价<5log2为阴性，判定为不合格。免疫合格率在70%以上则可判定为免疫合格场。

2.5.1 血凝试验（HA）

在V型微量反应板上每孔加入0.050mL生理盐水，在第一孔中加入0.050mL病毒悬液，为准备测定一个HA单位，在测试前作一系列的稀释，将病毒以0.050mL的体积做倍比稀释。每孔再加入0.050mmL生理盐水，每孔加入0.050mL1%的鸡红细胞。轻轻混匀，在室温条件下（20℃）静置40min，对照住红细胞应该明显呈纽扣状。判定血凝滴度:将板倾斜，观察红细胞有无蹭泪珠状流淌，完全血凝的最高稀释倍数代表一个血凝单位。

2.5.2 血凝抑制试验（HI）

微量反应板每孔加入0.050mL生理盐水。第1孔加入0.010mL样品血清。将血清做0.010mL体积作倍比稀释。倍比稀释至最后1孔，吸出0.010mL液体弃去。弃去之后，每孔加入含有4个单位的病毒抗原0.050mL，再每孔加入0.050mL的1%的鸡红细胞（在加入过程中应充分混匀，不间断的轻微振荡，防止血细胞凝结），混匀后放入水浴箱中静置30mL，对照组红细胞应该呈现显著地纽扣状，能完全抑制4个单位抗原的血清最高稀释度作为HI滴度。将板倾斜观察，可更确切的判定结果。只有那些红细胞同对照组孔几乎以同样比列泪流样的方可判定为抑制阳性。只有阴性对照血清滴度不大于1/4，阳性对照组血清误差不超过一个滴度，试验结果才有效。

3 结果

3.1 新城疫的抗体效价

表1 新城疫抗体效价分布情况

3.2 免疫合格率的判定

由表1可知新城疫抗体效价≥5log2为67%，这部分鸡免疫合格；抗体效价≥6log2和≥7log2的分别达到63%和56%，这部分的鸡获得了较高的保护性；但是抗体水平≥5log2百分率低于70%，说明此疫苗获得的免疫效果不是很好，没有达到预期的效果，不能有效的抵抗新城疫病毒，所以有新城疫病鸡零星的出现。

4 根据试验结果对该鸡场新城疫防治的建议

4.1 由试验结果可知新城疫抗体效价≥5log2的仅为67.65%，未达到规定的70%，说明结果免疫后，并没有达到预期效果，在免疫上存在缺陷，需要进行补免，否则一旦新城疫病毒入侵就有可能引发新城疫。

4.2 防制ND是一项十分艰巨和复杂的任务要采取严格的生物安全措施，防止NDV强毒进入。如日常的隔离、卫生、消毒制度[3]；防止一切带毒动物（特别是鸟类、鼠类和昆虫）和污染物进入禽群；进出的人员和车辆及用具消毒处理；饲料和饮水来源安全；不从疫区引进种蛋和苗鸡，新购进的鸡隔离观察2周以上证明健康者，方可合群；科学的畜牧制度，如全进全出等；禽场的选址、生产的规模等均有利于防止病原体进入[4]。

必须指出，很多禽场对以上措施认识不足，而过分依赖疫苗接种。今年来的研究表明，只要NDV强毒侵入禽群，就能长期传播维持，不论采用何种免疫措施都不能将其从群内清楚。在这个意义上，防止NDV强毒进入禽群是头等重要的防制措施[4]。

4.3 接种疫苗可以提高禽群的特异免疫力，减少NDV强毒的传播，降低ND造成的损失。ND免疫计划中疫苗的选择和合理免疫程序的制定受母体抗原高低、强毒感染危险大小、畜牧制度和其他感染存在多种因素影响，必须根据具体鸡群而确立，不能一概而论。ND传播迅速，死亡率很高，是严重危害养禽业的重要疾病之一，可造成巨大的经济损失。所以我们要做好鸡群的抗体水平监测工作，制订科学的免疫程序，科学确定首免、二免、三免日龄。

5 结论

通过本次试验的结果表明该鸡场为免疫不合格场，免疫合格率低于70%，必须经过补免或再次免疫，以提高该鸡场的免疫力，才能有效的防止新城疫病毒的入侵。该鸡场在免疫上存在很多问题，需要及时改正，严格按照科学的免疫程序，做好鸡群的抗体水平监测。

[1]郑明球.家畜传染病学实验指导[M].3版.北京:中国农业出版社，2001，107-111.

[2]黄文忠.鸡新城疫血凝抑制试验（HI）的影响因素[J].中国家禽，2000，22（5）:29.

[3]郑世军.鸡病免疫防制技术[M].北京:北京农业大学出版社，1994，47-51.

[4]徐宜为.最新禽病与防制[M].北京:中国农业科技出版社，1993，44-45.