牛支原体肺炎流行RT-PCR方法的初步诊断

张永强，张 维，王清华，吴研功，赵云玲，赵永刚，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心 国家外来动物疫病诊断中心，山东 青岛 266032）

近年来，我国部分地区肉牛发生以坏死性肺炎为主要特征的呼吸道传染病，病牛出现咳嗽，食欲不振，消瘦等症状，有的病牛出现继发性关节炎或腹泻[1-2]。本实验室对山东某一牛交易市场部分牛群进行鼻腔棉拭子采样，采用PCR方法对引起牛发生类似症状的主要支原体进行了检测。

1 材料与方法

1.1 样品采集

64份鼻腔棉拭子样品,采自山东某地一牛交易市场，该交易市场牛出现不明原因的发热、咳嗽等临床症状为主的传染性疫病。

1.2 酶、试剂和主要仪器

病毒RNA提取试剂盒、逆转录酶为罗氏公司产品；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD18-T载体以及限制性内切酶均购自大连宝生物公司；DNA纯化试剂盒SpinPrep Gel DNA Kit为Novagen公司产品；其他为国产分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 引物

根据NCBI上公布的支原体16S rRNA核酸序列，针对牛常见致病支原体，用Primer Premier 5.00软件设计5对引物（表1）。

1.3.2 RNA提取

按罗氏公司RNA提取试剂盒进行。

1.3.3 RT-PCR反应

以上述提取的总RNA做模板，对牛羊主要致病性支原体检测阳性的样品，分别用引物P1、P2、P3、P4、P5进行差异脲原体、牛支原体、牛生殖道支原体、牛眼支原体和丝状支原体丝状亚种（SC型）RT-PCR检测，将扩增产物克隆至质粒pMD18-T载体（宝生物工程大连有限公司），交由上海生工进行序列测定。

RT-PCR 反应体系为 25μL，模板 3μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，r-taq 0.6μL，HPR-I 0.5μL，MLV 0.25μL，上游引物（20 μ M）1μL，下游引物（20 μ M）1μL，Rnase free H2O 14.15μL。

反应程序：首先42℃40 min；接着95℃变性3 min；然后 94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环；最后72℃延伸7 min。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 牛支原体检测结果

对牛羊主要致病性支原体检测阳性的样品，进行牛支原体（P2）PCR 检测，阳性样品为 17、28、30、33、36、39、42（图 1）。

2.2 其他支原体检测结果

应用引物P1、P3、P4、P5对待检样品进行差异脲原体、牛生殖道支原体、牛眼支原体和丝状支原体丝状亚种（SC型）病原检测，结果均为阴性。

2.3 序列比对结果

将牛支原体PCR阳性产物克隆到pMD18-T进行测序并进行序列分析，利用BLAST软件进行序列同源性比较。结果显示，与GenBank中牛支原体（Mycoplasma bovis）16SrRNA 序列（GenBank登录号：AF332754）同源性为99%以上，因牛支原体属于无乳支原体的一个亚种，因此与无乳支原体（Mycoplasma agalactiae）也具有很高的同源性。对测序结果进行遗传进化树分析，结果显示，相比无乳支原体而言，所测序列，与牛支原体有更近的遗传距离（图2）。说明引起本次部分牛发病的病原可能是牛支原体。

3 讨论

牛支原体最早在1961年被鉴定为致乳腺炎的病原[4]，现在被认为是育肥牛、青年奶牛与犊牛呼吸道疾病与多发性关节炎的重要病因。牛支原体除了导致牛急性呼吸系统疾病外，还可导致持续性的慢性感染，以慢性支气管炎伴有肺干酪样或凝固性坏死病变为主。牛支原体常与细菌、病毒协同作用，环境因子如天气、通风不良、过度拥挤、运输等将加剧病情[5]。

患有牛支原体的病牛可通过鼻腔分泌物排出牛支原体，健康牛可通过近距离接触病牛而感染发病。牛支原体在环境中存活力差，但在无阳光情况下可存活数天，如4℃下可在海绵中或牛奶中存活2个月，或水中存活2周以上；20℃存活1～2周，或37℃存活1周。粪便中可存活37天[6]。常规消毒剂均可达到消毒目的。

本实验设计多对引物，采样PCR方法对临床采集的棉拭子样品进行了牛支原体、差异脲原体、牛生殖道支原体、牛眼支原体和牛传染性胸膜肺炎（CBPP）的病原学检测，对PCR产物进行测序，将序列与NCBI上进行比对证明所得序列与牛支原体和无乳支原体都具有很高的同源性。随后，将所得序列与牛羊主要致病支原体进行遗传进化分析，证明得到的核酸序列与牛支原体具有更近的遗传进化关系，从而更加确凿的证明了本次引起牛发病的病原是牛支原体。

[1]石磊，龚瑞，尹争艳，等.肉牛传染性支原体肺炎流行的诊断[J]. 华中农业大学学报，2008，27（5）：629-633.

[2]辛九庆.牛传染性胸膜肺炎诊断技术与分子流行病学研究[D].长春：吉林农业大学动物科学技术学院，2007.

[3]陈继明.重大动物疫病监测指南[M].北京：中国农业科学技术出版社，2008.

[4]HALE H H，HEMBOLDT C F，PLASTRIDGE W N.Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species[J].Cornell Veterinarian，1962，52：582-591.

[5]CASWELLJL，ARCHAMBAULTM.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle[J].Anim Health Rev，2007，8（2）：161-186.

[6]王桂芝.动物霉形体及研究方法 [M].北京：中国农业出版社，1998.