补肾调冲方对去卵巢大鼠性激素水平及下丘脑雌激素受体α、雌激素受体βmRNA表达的影响*

杜永红，李沛霖，韩 冰

（天津中医药大学第二附属医院，天津 300150）

补肾调冲方对去卵巢大鼠性激素水平及下丘脑雌激素受体α、雌激素受体βmRNA表达的影响*

杜永红，李沛霖，韩 冰

（天津中医药大学第二附属医院，天津 300150）

[目的]探讨补肾调冲方对去卵巢大鼠血清性激素水平及下丘脑雌激素受体α（ERα）、雌激素受体β（ERβ）mRNA表达的影响。[方法]以假手术组为对照，将去卵巢大鼠随机分为去卵巢空白组，补肾调冲方高、中、低剂量组，已烯雌酚组。采用放射免疫分析法测定血清雌二醇（E2）、促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）水平，采用逆转录-聚合酶联反应（RT－PCR）检测下丘脑ERα、ERβmRNA表达。[结果]去卵巢大鼠血清FSH、LH水平升高，E2及下丘脑ERα、ERβmRNA水平降低，补肾调冲方大鼠血清E2有升高趋势，FSH有降低趋势，补肾调冲方能降低去卵巢大鼠血清LH水平，升高下丘脑ERα、βmRNA的表达。[结论]补肾调冲方在改善去卵巢大鼠性激素水平同时，可能通过影响ERα、ERβmRNA的表达，提高ER的生物效应，从而降低更年期综合征的发生。

补肾调冲方；去卵巢大鼠；性激素；下丘脑；雌激素受体

更年期综合征是妇科常见病之一，是指妇女在绝经前后由于卵巢功能逐渐衰退、雌激素水平下降，出现以植物神经系统功能紊乱为主伴有神经心理症状的一组证候群。近年来该病有发病年龄提早、发病率上升的趋势，因而越来越受到人们重视。本实验选用去卵巢大鼠模型模拟更年期改变，从血清性激素水平及下丘脑雌激素受体（ER）方面探讨补肾调冲方的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物与实验动物环境 雌性Wistar大鼠，体质量（200±10）g(由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,合格证编号：2002-031)。饲养于天津中医药大学动物实验中心，室温为（20±2）℃，自由摄食和饮水。在实验环境中分笼适应性喂养5 d后进行实验。

1.2 实验药品 补肾调冲方，组成：菟丝子15 g，黄精 15g，熟地黄 15g，肉苁蓉 10g，当归 10g，川芎 6g，由天津安舜药房提供。水煎后浓缩定容，相当于原生药2.4 kg/L的药物，4℃冰箱保存备用。已烯雌酚片:天津力生制药厂生产（批号：0501001）。

1.3 主要实验试剂 雌二醇（E2）放免试剂盒，批号:RG 66-04,购自天津九鼎公司；促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）放免试剂盒，批号：051220，购自北京北方生物技术研究所。ImProm-Ⅱ反转录酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTP）、随机引物pd(N)6购自美国Promega公司；异硫氰酸胍、焦碳酸二乙酯（DEPC）、β-巯基乙醇等购自美国Simga公司；Taq DNA聚合酶、三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）、水饱和酚、超纯水和DNA分子量标准Marker等购自北京鼎国生物技术有限公司；其他生化试剂为国产分析纯。

1.4 主要实验仪器 γ放射免疫计数仪16探头CAPRIA-16，美国；紫外分光光度计（B ioPhotomete r），德国；台式高速冷冻离心机（3K18），美国；聚合酶链反应（PCR）扩增仪（TH-48a），杭州大和热磁有限公司；-80℃超低温冰箱，美国；多功能电泳仪，北京六一仪器厂；自动凝胶图像分析系统，上海天能科技公司。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立及分组 在适应环境5 d后，10%水合氯醛，按3mL/kg腹腔注射，将大鼠麻醉成功后，行双侧卵巢切除手术。假手术组按同法操作，仅摘除卵巢周围部分脂肪。

动物去卵巢1周后连续5 d作阴道细胞学涂片，有动情周期变化者为去卵巢不彻底，予以剔除。假手术组大鼠阴道脱落细胞涂片动情周期正常。

实验动物按随机数字表法随机分为补肾调冲方高、中、低剂量组，已烯雌酚组，去卵巢空白组，假手术组。

2.2 给药方法 补肾调冲方高、中、低剂量组分别按38.16、19.08、9.54 g/kg体质量（相当于临床等效剂量4、2、1倍）灌胃。已烯雌酚组:研碎，加水配成混悬液，按0.1mg/kg体质量灌胃。去卵巢空白组：以生理盐水l0mL/kg体质量灌胃。1次/d，连续60 d。

3 检测指标与方法

3.1 血清E2、FSH、LH放免测定及方法 末次给药24 h后股动脉取血。血液静置40min后，3 500 r/min离心15min，分离血清，置于-20℃低温冰箱保存待测。采用放射免疫分析法测定，按试剂盒操作。

3.2 下丘脑雌激素受体α（ERα）、雌激素受体β（ERβ）mRNA检测及方法。

3.2.1 实验动物取材方法 末次给药24 h后断头处死大鼠，立即取出全脑并在冰浴上分离下丘脑，将组织置于-70℃液氮中保存备用。

3.2.2 检测基因的引物设计与合成 按照引物设计原则及所需实验条件，根据Genbank核酸数据库中的大鼠ERα、ERβ和看家基因G3PDH基因序列设计引物，ERα 引物序列：5′-AATTCTGACAATCGACGCCAG-3′，5′-GTGCTTCAACATTCTCCCTCCTC-3′，扩增片段长度 345 bp；ERβ：5′-TTCCCGGCAGCACCAGTAACC-3′，5′-TCCCTCTTTGCGTTTGGACTA-3′，扩增片段长度260 bp。全部引物由上海生物工程有限公司合成，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。

3.2.3 RNA的提取 参照Promega的RNAgents总RNA提取试剂盒，异硫氰酸胍一步法提取，紫外分析仪检测浓度及纯度，λ260/λ280比值在1.7～2.0之间，达到了进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的要求。

3.2.4 逆转录反应（RT） 每个反应取2μg总RNA，随机引物p d（N）62μL和DEPC水，合计11.6μL混合，70℃热变性10min，迅速冰浴冷却3min；加入5×ImProm-Ⅱ逆转录酶缓冲液4.0μL，ImProm-Ⅱ逆转录酶（10U/μL）1.0μL，25m mol/L MgCl22.4μL，dNTP混合物（10m mol/L）1.0μL，混匀，37℃ 90min。

3.2.5 聚合酶反应（PCR） PCR的扩增体系为25μL，其中包括逆转录产物2μL，PCR主反应液21μL，上/下游引物（10 μmol/L）1 μL，Taq 酶(1U/μL)1 μL。ERα、ERβPCR 反应条件：94 ℃ 2min，94 ℃ 1min，60℃1min，72℃45秒。

3.2.6 凝胶电泳分析 取PCR产物5μL，2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭（EB）染色，应用GIS-2010凝胶图像分析系统照相、读取灰度值并进行分析。

4 数据处理

实验数据应用SPSS 11.5统计学软件进行分析。各组数据均以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

5 结果

5.1 血清E2、FSH、LH的测定结果 见表1。

表1 补肾调冲方对去卵巢大鼠血清性激素水平影响（±s，n=8）Tab.1 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone in ovariectom ized rats（±s，n=8）

表1 补肾调冲方对去卵巢大鼠血清性激素水平影响（±s，n=8）Tab.1 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone in ovariectom ized rats（±s，n=8）

注：与去卵巢空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与乙烯雌酚组比较，○P<0.05。

组别E2（g/L）FSH（IU/L）L H（IU/L）补肾调冲方高剂量组 5.357±2.416△△○ 2.669±0.596△△○ 3.115±0.793*补肾调冲方中剂量组 6.583±1.648△△○ 2.567±0.359△△○ 3.019±0.735*补肾调冲方低剂量组 4.398±1.425△△○ 2.681±0.271△△○ 3.371±0.586△已烯雌酚组 9.468±2.029** 2.116±0.335** 3.062±0.683*去卵巢空白组 4.391±1.558△△ 2.758±0.388△△ 3.982±0.589△△假手术组 11.676±3.994** 1.770±0.448** 2.533±0.826**

结果表明大鼠切除卵巢后，外周血E2水平明显降低，与假手术组比较有显著性差异（P＜0.01）；已烯雌酚组大鼠血清E2水平升高，与假手术组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方组血清E2水平有升高趋势，与去卵巢空白组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方组与已烯雌酚组比较有显著性差异（P<0.05）。

大鼠切除卵巢后，外周血FSH水平升高，与假手术组比较有显著性差异(P<0.01)；已烯雌酚组大鼠血清FSH水平降低，与假手术空白组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方组血清FSH水平有降低趋势，与去卵巢空白组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方组与已烯雌酚组比较有显著性差异（P<0.05）。

大鼠切除卵巢后，外周血LH水平升高，与假手术组比较有显著性差异（P＜0.01）；补肾调冲高、中剂量方组和已烯雌酚组大鼠血清LH水平降低，与假手术组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方低剂量组和去卵巢空白组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方组与已烯雌酚组比较无显著性差异（P>0.05）。

5.2下丘脑ERα、ERβmRNA的测定结果 半定量RT-PCR产物电泳分析见图 1、2。以管家基因G3PDH为参照，分析ERα、ERβ在各组间的不同表达。

表2 补肾调冲方药对去卵巢大鼠下丘脑 ERα、ERβm RNA 的影响（±s，n=8）Tab.2 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the ERα,ERβm RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats（±s，n=8）

表2 补肾调冲方药对去卵巢大鼠下丘脑 ERα、ERβm RNA 的影响（±s，n=8）Tab.2 Effectof Bushen Tiaochong decoction on the ERα,ERβm RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats（±s，n=8）

注：与去卵巢空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

组别 ERα/G3PDH ERβ/G3PDH补肾调冲方高剂量组 0.714±0.216** 0.870±0.126**补肾调冲方中剂量组 0.783±0.193** 0.887±0.082**补肾调冲方低剂量组 0.325±0.128△△ 0.838±0.084**已烯雌酚组 0.569±0.179** 0.819±0.053**去卵巢空白组 0.220±0.073△△ 0.603±0.138△△假手术组 1.093±0.169** 0.921±0.130**

去卵巢空白组大鼠下丘脑ERαmRNA明显降低，与假手术组比较有显著性差异（P<0.01）；补肾调冲方高、中剂量组、已烯雌酚组表达增加，与去卵巢空白组比较有显著性差异（P<0.01）；补肾调冲方低剂量组与去卵巢空白组比较无显著性差异（P>0.05），与假手术组比较有显著性差异（P<0.01）；补肾调冲方高、中剂量组与已烯雌酚组比较无显著性差异（P>0.05）。

去卵巢空白组大鼠下丘脑ERβmRNA降低，与假手术组比较有显著性差异（P<0.01）；补肾调冲方组、已烯雌酚组能增加去卵巢大鼠下丘脑ERβmRNA表达，与去卵巢空白组相比较有显著性差异（P<0.01），与假手术组比较无显著性差异（P>0.05）；补肾调冲方组与已烯雌酚组比较无显著性差异（P>0.05）。

6 讨论

中医学认为肾-天癸-冲任对女性生殖机能调节起着重要作用，其中冲任二脉的盛通乃是妇女产生经、孕、产、乳的先决条件，而肾气的盛衰是决定冲任盛衰的关键。绝经前后肾气渐衰，或受禀赋不足，或房劳多产等因素影响，导致肾脏虚衰，冲任亏损，天癸渐竭，阴精耗伤，阴阳平衡失调，脏腑功能紊乱而出现绝经前后诸症，故韩冰教授以补肾调冲法作为治疗更年期综合征的基本法则，贯穿于治疗始终[1]。补肾调冲方中菟丝子甘、辛，其性平，补而不滞、守而不走，具有补肾养肝，阴阳两调、精气并补之功效；黄精甘、平，可“补虚填精”（《滇南本草》），“平补气血而润”（《本草从新》）；熟地黄味甘，微温，“能补肾中元气”（《本经逢原》），补任脉之阴；肉苁蓉性味甘温，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥等功效，可以补冲任之气；当归甘、辛、温，可养血滋肝，调经固冲；川芎辛、温，具活血行气、调经之功，两者可调补冲任之气血。全方具有温补肾阳、滋养肾阴、调理冲任、养血调经的功效。

下丘脑-垂体-卵巢轴（H-P-O轴）是女性性腺轴，研究表明：卵巢机能衰退较快或比较突然，雌激素水平突然下降或下降迅速，以致植物神经系统不能很好的适应而发生机能紊乱导致更年期综合征，所以笔者选用去卵巢大鼠作为更年期模型。更年期的机能紊乱伴随着脑尤其是下丘脑神经元和功能的紊乱[2]。下丘脑是神经内分泌高级整合中枢，同时也接受卵巢分泌的性激素的调控。雌激素的生物学作用由ER介导，在下丘脑ER分布广泛，尤其是在H-P-O轴上[3]。雌激素受体有α、β两种亚型，在更年期大鼠下丘脑中ERα、ERβ蛋白表达量明显下降[4]。ERmRNA的转录和翻译对ER表达起着重要的作用。本研究结果显示，大鼠去卵巢后，由于血中E2水平下降，解除了对下丘脑和垂体的负反馈调节，导致FSH和LH水平的升高；同时对ER的正相调节作用减弱，使下丘脑ERα、ERβmRNA表达降低。激素补充治疗能够有效缓解更年期症状，但因有禁忌证及长期使用存在的潜在风险性，而使临床应用受到一定局限。韩冰教授在深入研究中医典籍的基础上，结合多年临床实践，运用补肾调冲方治疗更年期综合征等多种功能失调性卵巢疾病，取得了显著疗效。研究结果显示补肾调冲方虽未能明显提高血清E2水平，但可能通过降低LH水平，改善去卵巢大鼠性激素水平，同时上调去卵巢大鼠下丘脑ERα、ERβmRNA 的表达，使 ERα、ERβ 合成增加，从而提高ER的生物效应，降低了更年期综合征的发生。但是否与通过增强下丘脑芳香化酶催化雄激素转化为雌激素能力，从而提高了下丘脑局部雌激素的含量有关，有待进一步探讨。

[1]孙文墅.韩冰教授补肾调冲法治疗妇科疾病经验[J].天津中医，1992，9（1）：6-8.

[2]林守清，林 萍，姜玉新，等.绝经后卵巢和子宫萎缩及血雌二醇降低的观察[J].中华妇产科杂志，1997，32（9）：524－527.

[3]师莉莉，薛晓鸥，姜恩魁.雌激素受体与女性生殖轴关系的研究进展[J].锦州医学院学报，2004，25（6）：47－49.

[4]纪 中，崔清志，田艳君，等.益坤宁对围绝经期大鼠下丘脑雌激素受体表达的影响[J].中国比较医学杂志，2009，19（8）：58－60，80.

Effectsof the Bushen Tiaochong decoction on the levelsof serum sex hormone and the expression levelsof estrogen receptorsα,β m RNA in the hypothalamus in ovariectom ized rats

DUYong-Hong，LIPei-lin，HANBing
（The Second Affiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300150,China）

[Objective]To investigate the effectsof the Bushen Tiaochong decoction on the levelsofserum sex hormone and the expression levels ofestrogen receptorsα,β (ERα,ERβ)mRNA in the hypothalamus in ovariectomized rats.[Methods]Sham operation group wasconsidered ascontrol,castrated ratswere divided into fourgroups:ovariectomized blank group,Bushen Tiaochong decoction high dose group,moderate dose,low dose group,Diethylstilbestrol group.The levels of serum E2,FSH,LH were determraed by radioimmunoassay method,and the RT-PCRmethod wasused to detect the expression levelsof ERα,ERβ mRNA in the hypothalamus.[Results]The levels of serum FSH,LH in ovariectomized ratswas higher aswell as the levels ofestrogenic and ERα,ERβ mRNA in the hypothalamuswas lower.Bushen Tiaochong decoction group on the levelsofserum estrogenic in ovariectomized ratshasa rising trend and the levelsof FSH has a declining trend.Bushen Tiaochong decoction reduced the levels of serum LH and increased the expression levels ofα,βmRNA in the hypothalamus.[Conclusion]Bushen Tiaochong decoction improve the levelsofsex hormones in ovariectomized rats and through increasing the expression levelsofERα,ERβ mRNA to improve ER biologicaleffectsand reduce the occurrence ofmenopausalsyndrome.

Bushen Tiaochong decoction；ovariectomized rats；sex hormone；hypothalamus；estrogen receptor

R692.5

A

1672-1519(2011)03-0240-04

国家自然科学基金项目（81072837）。

杜永红（1970-），女，博士，主治医师，研究方向妇科内分泌。

2011-02-03）