白附子混悬液对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫调节机制研究*

于晓红，宋 娜，胡艳文

（1.黑龙江中医药大学微生物学与免疫学教研室，哈尔滨 150040；2.天津市塘沽区妇幼保健院，天津 319000)

白附子混悬液对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫调节机制研究*

于晓红1，宋 娜1，胡艳文2

（1.黑龙江中医药大学微生物学与免疫学教研室，哈尔滨 150040；2.天津市塘沽区妇幼保健院，天津 319000)

[目的]研究白附子混悬液对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用，探讨其抗肿瘤作用的免疫学机制。[方法]采用H22荷瘤小鼠模型为研究对象，用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测小鼠血清中白介素-2（IL-2）和白介素-4（IL-4）水平；用流式细胞术（FACS）法分析对CD4+，CD8+T细胞的调节作用。[结果]白附子混悬液能够上调荷瘤小鼠血清IL-2细胞因子的表达，降低IL-4水平，可以使CD4+T细胞表达升高，CD8+T细胞表达降低。[结论]白附子混悬液能够通过调节荷瘤机体异常免疫功能状态而发挥抗肿瘤作用。

白附子混悬液；H22细胞；免疫调节

白附子，为天南星科多年生草本植物独角莲（Typhonium giganteum Engl）的块茎。产于河南、甘肃、湖北、黑龙江等地。味微辛，性温，有毒，归胃，肝经。具有祛风痰、燥湿、定惊、散结止痛之功效，外用治瘰疬痰核[1]。白附子的化学成分及药理作用近年来已有报道，主要含有脂肪酸、甾体类化合物、挥发油成分、氨基酸和微量元素等。白附子的药理学作用主要有抗炎、镇静、抗惊厥、止痛，并对多种恶性肿瘤具有一定的抑瘤效果[2－5]。白附子治疗各种肿瘤在民间广为应用，但目前尚无对其抗肿瘤作用的免疫调节机制的研究报道[6]。前期研究表明白附子混悬液（SGTR）通过体内免疫调节抗肿瘤，抑瘤率可达

39.14%。在前期研究的基础上，本课题组进一步对白附子混悬液抗肿瘤的免疫调节机制进行深入研究分析，为研制一新型抗肿瘤辅助药物提供现代免疫学资料。

1 实验材料和方法

1.1 动物 选用健康昆明种小鼠（KM），（20±2.0）g（6～8周龄），雌雄各半，购于黑龙江中医药大学动物实验中心。许可证号：黑医实验动物单项准第61号。

1.2 H22瘤株 由哈尔滨医科大学肿瘤研究所提供。

1.3 药物及试剂

1.3.1 药物 1）白附子鲜品购于黑龙江省五常市，经黑龙江中医药大学生药实验室专家鉴定为天南星科植物独角莲的块茎。去须、洗净、切成约2mm的厚片，经60℃烘干粉碎，过80目筛，临用时以双蒸馏水溶解成不同浓度（按倍比稀释法）。2）环磷酰胺注射液（CTX），由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，产品批号：06111521。

1.3.2 试剂 抗CD4-藻红蛋白（PE）和抗CD8-异硫氰酸荧光素（FITC）单抗，小鼠白介素-2（IL-2）试剂盒和小鼠白介素-4（IL-4）试剂盒（为深圳晶美生物工程有限公司产品）。

1.4 仪器 酶联免疫检测仪（anthos 2010 17750，Austria）；微量加样器（SOCOREX，瑞士）；FACSCALIBUR流式细胞仪（BD公司,美国）；电热恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；低温超速离心机（KDC-160HR，安徽，合肥）等。

1.5 动物模型的制备 无菌取第8天转移癌H22腹水（计活细胞大于95%），用0.9%生理盐水稀释成2×106个/mL，取健康纯系昆明种小鼠40只，18～22 g（6周龄），雌雄各半，每只鼠右侧腋部皮下接种0.2mL瘤细胞悬液，然后将荷瘤鼠按照随机数字表法随机分为4组，每组10只（雌雄各半），分别为模型组、实验组、环磷酰胺组和联合用药组，另取10只未接种荷瘤的小鼠（雌雄各半）作为正常对照组。

1.6 动物分组及给药方法 正常对照组：生理盐水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理盐水0.2mL；模型组：生理盐水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理盐水0.2mL；实验组：白附子混悬液[825mg/（kg·d）]灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射生理盐水0.2mL；环磷酰胺组：生理盐水灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射CTX[30 mg/(g·d)]0.2 mL；联合用药组：白附子混悬液[825mg/（kg·d）]灌胃0.02mL/（g·d），腹腔注射CTX[30mg/（kg·d）]0.2mL。

以上各组均从实验第2天开始给药，每日1次，连续10 d。称质量后，眼球取血，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡消毒后剥离瘤组织。

1.7 测定方法

1.7.1 小鼠外周血IL-2水平的测定 原理：酶标双抗体夹心法。1）小鼠眼球取血，置于离心管中，分离血清（3 000 r/min，离心 5min）。2）从密封袋中取出所需板条，平衡至室温。3）除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品（每孔100μL）加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min，洗板4次。4）除空白孔外，加入生物素化抗体工作液（每孔100μL）。封住板孔，37℃孵箱孵育60min，洗板4次。5）除空白孔外，加入酶结合物工作液（每孔100μL）。封住板孔，37℃孵箱孵育 30 min，洗板4次。6）加入显色剂（每孔100μL），避光37℃孵箱显色15min，加入终止液（每孔100μL），混匀后即刻测量OD492值（5min内）。

1.7.2 小鼠外周血IL-4水平的测定 实验原理、方法基本同于IL-2测定。

1.7.3 流式细胞术（FACS）法测定T淋巴细胞CD4+和CD8+细胞亚群 取抗凝血100μL放于试管中，分别加入抗CD4-藻红蛋白（PE）和抗CD8-异硫氰酸荧光素（FITC）单抗各 10μL，置室温避光 20min，加入红细胞裂解液2mL，离心弃上清液，加磷酸盐缓冲液（PBS）洗液2mL混匀，离心后弃上清液，加入固定液600μL，4℃存放至少30min后，流式细胞仪测定。

2 实验结果

2.1 白附子混悬液对H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4的影响 见表1。模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。实验组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），结果接近正常对照组水平（P>0.05）。环磷酰胺组的IL-2水平与模型组比较无统计学意义（P>0.05），与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；而 IL-4水平低于模型组（P<0.01），表明CTX（环磷酰胺注射液）对荷瘤小鼠IL-2的表达无明显调节作用，且有较强的抑制作用。联合用药组IL-2水平与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），说明两药合用后能够调节机体的免疫状态，降低CTX(环磷酰胺注射液)的免疫抑制作用，但尚不能使IL-2水平得以完全纠正。

表1 白附子混悬液对H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4 的影响（±s）Tab.1 Effectsof SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearingm ice（±s）

表1 白附子混悬液对H22荷瘤小鼠血清IL-2，IL-4 的影响（±s）Tab.1 Effectsof SGTR on serum IL-2，IL-4 in H22 tumor bearingm ice（±s）

注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，▲▲P<0.01。

组别 n正常对照组 10模型组 10实验组 10环磷酰胺组 10联合用药组 10 IL-2（ng/L） IL-4（ng/L）164.47±10.95 101.36± 6.21 114.68±11.09** 133.21±10.22**158.10± 8.66▲▲ 99.80± 7.56▲▲112.48±11.25** 93.97± 4.77▲▲130.95±15.11**▲▲ 94.88± 6.69▲▲

2.2 白附子混县液对H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+细胞的影响 见表2。模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。实验组与模型组比较差异，有统计学意义（P<0.01），结果接近正常对照组水平（P>0.05），能够使 CD4+细胞回升，CD8+细胞有所回落，明显改善CD4+/CD8+的失衡状态。环磷酰胺组与正常对照组和模型组比较差异均有统计学意义（P<0.01），CD4+细胞、CD8+细胞均明显降低。联合用药组的CD8+细胞水平接近正常对照组（P>0.05），CD4+细胞水平与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），说明两药合用能够部分改善环磷酰胺的抑制作用，调节机体CD4+/CD8+失衡状态。

表2 白附子混悬液对H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+细胞的影响（±s）Tab.2 Effectsof SGTR on blood CD4+，CD8+cells in H22 tumor bearingm ice（±s）

表2 白附子混悬液对H22荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+细胞的影响（±s）Tab.2 Effectsof SGTR on blood CD4+，CD8+cells in H22 tumor bearingm ice（±s）

注：与正常组相比，**P<0.01；与模型组相比，▲▲P<0.01。

组别 n正常对照组 10模型组 10实验组 10环磷酰胺组 10联合用药组 10 CD4+细胞 CD8+细胞 CD4+/CD8+46.09±2.07 22.62±1.68 2.05±0.22 40.00±1.65** 28.86±1.58** 1.39±0.09 45.19±0.90▲▲ 24.00±1.24▲▲ 1.92±0.11 37.17±1.52**▲▲ 17.92±1.22**▲▲ 2.08±0.15 40.62±1.89** 22.64±2.31▲▲ 1.81±0.23

3 讨论

荷瘤小鼠外周血T细胞亚群比例出现异常，表现为CD4+T细胞减少，CD8+T细胞增多，这些变化可以通过CD4+/CD8+比值得到更敏感的反映。即荷瘤机体CD4+/CD8+比值下降，小鼠机体免疫功能减弱。CD4+T细胞可分化为TH1细胞和TH2细胞，其诱导因素有：由感染引发的细胞因子[主要是干扰素（IFN）-γ、IL-12和IL-4]、启动免疫应答的协同刺激信号以及肽-主要组织相容性复合物（MHC）的性质。IL-4可促进CD4+T细胞分化成TH2。模型组荷瘤小鼠IL-2水平明显下降，IL-4水平明显升高，说明荷瘤小鼠免疫功能处于紊乱状态，TH2细胞相对处于优势地位，抑制了抗肿瘤特异性免疫应答TH1细胞的优势状态。

用白附子混悬液治疗后，能使荷瘤小鼠CD4+T细胞表达增加，CD8+T细胞表达降低，可以明显改善CD4+/CD8+比值的失衡状态，恢复机体正常的免疫状态，从而发挥抗肿瘤的作用。同时白附子混悬液能够促进荷瘤小鼠IL-2的表达，使IL-4水平有所下降，使荷瘤小鼠的IL-2、IL-4水平接近正常对照组，说明白附子混悬液能够促进荷瘤小鼠TH1型细胞因子的表达，使荷瘤小鼠由TH2型细胞因子优势状态向TH1型逆转，纠正TH1/TH2漂移，从而增强荷瘤机体的细胞免疫功能，提高荷瘤机体的抗肿瘤能力。

白附子混悬液与CTX合用后，CD4+细胞、CD8+细胞均有所回升CD8+细胞水平接近正常对照组，说明两药合用能够部分改善CTX对荷瘤小鼠的细胞免疫抑制作用，调节机体CD4+/CD8+的失衡状态。同时能使IL-2表达水平提高，说明两药合用后能够调节荷瘤机体的免疫状态，降低CTX对荷瘤小鼠细胞免疫的抑制作用，但尚不能使IL-2水平得以完全纠正。

综上，白附子混悬液可以改善荷瘤机体CD4+/CD8+的失衡状态，促进IL-2等TH1型细胞因子的表达，纠正荷瘤机体TH1/TH2漂移，提高荷瘤机体的细胞免疫功能而发挥抗肿瘤效应。

[1]孙 燕，赵 平.临床肿瘤学进展[M].北京：中国协和医科大学出版社，2005：3－8.

[2]詹启敏.分子肿瘤学[M].北京：人民卫生出版社，2005：66－104.

[3]姜文奇，张晓实，朱孝峰.肿瘤生物治疗学[M].广州：广东科学技术出版社，2006：4－7.

[4]陈丙英，陈子兴.分子生物学基础与临床[M].福州：东南大学出版社，2000：15-30.

[5]张天泽，徐光炜.肿瘤学[M].天津：天津科学技术出版社，2005:825.

[6]于晓红，梅 蕾，颜培宇，等.山核桃树枝水煎剂对荷瘤鼠P53和PCNA 基因表达的影响[J].天津中医药，2007，24（5）：399－401.

The immuneadjustmentmechanism ofanti-tumor efficacy of SGTR on H22tumor bearingm ice

YUXiao-hong1,SONGNa1,HUYan-wen2
(1.DepartmentofMicrobiology and Immunology,Heilongjiang University of TCM,Harbin 150040,China;2.Maternaland Child Health Hospitalof Tianjin Tanggu District,Tianjin 319000,China)

[Objective]Study the adjustment function of SGTR on the immune system of tumor-bearingmice and investigate the immunologicalmechanism of the inhibition function ofSGTR on tumor’sgrowth.[Methods]H22tumorbearingmicewere as the research object.Wemeasured the levels of IL-2 and IL-4 in serum with ELISA method,and the influence of SGTR on CD4+、CD8+T cell with FACS method.[Results]SGTR can improve the expression of IL-2 cytokines in H22tumorbearingmice's serum,lower the levelof IL-4,increase the expression ofCD4+T cells,and reduce the expression ofCD8+T cells in H22tumorbearingmice.[Conclusion]SGTR could play a role ofanti-tumoractivity by regulating the body’sabnormal immune function in tumor-bearing state.

SGTR;H22cells;immune regulation

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0326-03

黑龙江省科技攻关计划项目（GOOC201301）。

于晓红（1958-），女，教授，硕士研究生导师，主要从事中医药抗肿瘤的免疫学研究。

2011-04-26）