结直肠癌患者门静脉血p27基因甲基化检测及其临床意义

陈积贤，张 洁，任振华，薛迪新，吴伟力，张仁虎，余 铭，林道浙，林 肖，黄建武，梁美珍，贺先伟，徐 平

p27蛋白是Polyak等于1994年在转化生长因子－β(TGF－β)处理的生长抑制细胞及接触生长抑制的细胞株中发现的一种相对分子质量为27 kd的耐热细胞周期抑制蛋白，是p27基因的产物，属kip类，与p21、p57功能相似。新近发现它属于细胞周期素 (cyclin)－周期素依赖性蛋白激酶 (CDK)抑制蛋白，能与cyclin－CDK复合物结合，控制细胞由G1期进入S期的“位点”，从而抑制细胞增殖［1］。国外学者认为p27基因在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色，认为其抑癌作用可能是其产物p27蛋白在转录后水平以化学剂量方式与cyclin－CDK复合物，尤其是cyclin－CDK2复合物结合，阻止细胞增殖通过限制点—— “位点”的最关键因素，从而使细胞周期停止在G1期。但是在研究中很少发现有p27基因的缺失及突变。如果p27蛋白水平低下或缺失，可以导致细胞过度增殖，引起肿瘤发生。而表观遗传修饰方式之一的甲基化事件与基因的表达有密切联系。所以本实验利用MSP甲基化检测血液标本中p27的启动子甲基化水平改变，并探讨其与结直肠癌发生、发展、临床分期、分化程度和淋巴结转移临床病理的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院肿瘤外科2007年2月—2009年12月手术治疗的结直肠癌患者106例为研究对象。其中男63例，女43例;年龄＜60岁48例，≥60岁58例;Dukes分期:A+B期55例，C+D期51例;肿瘤部位:右半结肠16例，左半结肠32例，直肠58例;肿瘤大小:＜5 cm 67例，≥5 cm 39例;浸润深度:未达浆膜层29例，达浆膜层77例;有淋巴结转移41例，无淋巴结转移65例;分化程度:低分化25例，高中分化81例。选取同期健康体检的正常者29例为对照组。

1.2 实验方法 基因甲基化状态分析:采用德国QIAGEN公司生产的QIAamp Blood Mini KIT试剂盒提取血清。每份标本使用2.5 ml血清，按照说明书提取DNA并定量，按文献方法略作修改进行DNA的亚硫酸氢盐处理，针对修饰过的p27启动子CpG岛序列，分别设计甲基化、非甲基化特异引物扩增目的片段。引物序列为27M:5'－AAGA GGCGAGTTAGCGT－3;5'－AAAACGCCGCCGAACGA －3;27U:5'－ATGGAAGAGGTGAGTTAGT－3';5'－AAAACCCCAATTAAAAACA－3';反应条件:94℃，10 min预变性后接由95℃，45 s;66℃，45 s;72℃，45 s三步组成的35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物长度p27M:195 bp(碱基对)、p27U:212 bp。甲基化特异性的PCR反应体系为25μl，包括2μl的修饰DNA，1×PCR bufferII(Perkin－Elmer)，2 mmol/L MgCl2，0.25 mmol/L dNTP，上下游引物各1μmol/L，和1 U AmpliTaq Gold polymerase(Perkin－Elmer)，反应条件:首先95℃变性10 min，然后95℃变性30 s，特定温度退火45 s，延长72℃，45 s，共40个扩增循环。实验设阳性对照 (试剂盒提供)，不含DNA的蒸馏水作为阴性对照。10μl的PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，运用图像采集与分析统，记录并分析电泳结果，所有试验均重复三次。

1.3 统计学方法 数据均在SPSS 11.5软件上处理，计数资料采用χ2检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p27基因甲基化状态 以门静脉血为实验材料，检测p27基因启动子区域的甲基化情况。甲基化特异性引物扩增的条带则标本计为甲基化 (M)，未甲基化特异性引物扩增条带则标本计为未甲基化 (U)，电泳结果显示在特异引物参与下PCR扩增后的特异性片段 (见图1)。

2.2 p27基因甲基化与结直肠癌患者临床病理特征的关系106例结直肠癌患者中，p27基因甲基化阳性率与患者的性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤大小均无统计学意义 (P＞0.05);而p27基因甲基化阳性率与结直肠癌的浸润深度、分化程度、Dukes分期及有无淋巴结转移均有统计学意义 (p＜0.05，见表1)。

表1 结直肠癌患者门静脉血p27基因甲基化与临床病理的关系Table 1 Methylation level in p27 promoter and its relationship with clinical feature

2.3 两组静脉血中p27甲基化发生情况 外周静脉血的p27基因甲基化检测结果显示:29例对照组的甲基化阳性率为3.4%(1/29)，结直肠癌患者外周静脉血p27基因甲基化阳性率为24.5%(26/106)，两组p27基因甲基化阳性率比较，差异有统计学意义 (χ2=6.324，p＜0.01)。结直肠癌患者门静脉血中p27基因甲基化阳性率为30.2%(32/106)，与外周血p27基因甲基化阳性率比较，差异无统计学意义 (χ2=0.854，P＞0.05)。

3 讨论

细胞周期调控因子是一组调节细胞增殖、分化的正负信号，它们之间的相互作用促进和抑制细胞周期的正常进程。目前越来越多的研究表明肿瘤的发生发展与肿瘤细胞周期的调控失常有关，而细胞周期调控因子的异常是重要原因。p27作为细胞周期的负调控因子，自发现以来一直被视为候选的抑癌基因［2－3］。p27基因是一种相对分子质量为27 kd的耐热细胞周期抑制基因，属kip类，与p21、p57功能相似。国外学者认为p27基因在肿瘤的发生发展中起着重要作用，但很少发现有p27基因的缺失及突变，认为其抑癌作用可能是其产物p27蛋白在转录后水平以化学剂量方式与cyclin－CDK复合物，尤其是cyclin－CDK2复合物结合，阻止细胞增殖通过限制点——位点的最关键因素，从而使细胞周期停止在G1期［4］。p27蛋白水平低下或缺失，可导致细胞过度增殖，引起肿瘤发生。

DNA甲基化参与真核生物基因表达调控，抑癌基因的高甲基化与其失活和异常表达有关，这可能是肿瘤发生、发展的一个重要因素［5－6］。近来，基因启动子区CpG岛的高甲基化引起基因失表达已成为肿瘤研究的热点。在对多种肿瘤包括消化系肿瘤、肝癌、乳腺癌等的p27研究中，p27启动子区域甲基化异常与肿瘤的恶性进展相关，提示p27低表达与结肠癌的进展及转移密切相关，可作为结肠癌病理生物学行为的观测指标。崔静等［7］对于98例结直肠癌患者研究发现p27基因异常甲基化是p27失活的主要机制，与结直肠癌的发生、发展密切相关。另外，乳腺癌患者检查发现其组织中p27的启动子区域存在高甲基化状态，且有显著性相关［8］。药物学研究中，使用阻遏甲基化反应的药物CdR对于胃癌细胞系增殖具有明显的抑制作用，其可能的机制是p27基因的甲基化状态得到了逆转［9］。

在研究启动子区域甲基化水平的方法中，DNA甲基化特异性PCR法具有简便易行、灵敏度高等特点，可用于临床少量标本的检测，能为肿瘤的早期诊断、生物学行为及预后分析提供指导意义。

结直肠癌患者外周血p27基因甲基化水平上升，但是外周血离病灶较远，可能存在阳性癌细胞被稀释。为了更准确地反映p27基因甲基化与结直肠癌临床病理特征的关系，本实验采集了与病灶更接近的门静脉血作为甲基化水平检测标本。门静脉血的甲基化阳性率与外周血无差异。本研究探讨了p27基因甲基化与结肠癌生物学行为的关系，结果显示p27基因甲基化程度与肿瘤浸润的深度、临床分期、恶性程度及有无淋巴结转移有关。这些结果提示p27基因异常甲基化可能与结肠癌患者的临床生物学行为有关，可作为判断结直肠癌预后的参考指标。

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2 Li M，Li JY，Zhao AL，et al.Survival stratification panel of colorectal carcinoma with combined expression of carcinoembryonic antigen，matrix metalloproteinases－2，and p27 kip1 ［J］.Dis Colon Rectum，2007，50(11):1887－1898.

3 李玉华，孙炜，孙炯.卵巢上皮癌组织中p27蛋白的表达及其临床意义［J］.中国全科医学，2009，12(7):1211.

4 Mitti ML，Calfano D，Troncone G，et al.Complex regnlalion of the cyclin－dependent kinase inhibitor p27kipl in thyroid cancer cells by the PIJK/AKT pathway:regulatim of p27kipI expression and localization［J］.Am J Pathol，2005，166:737 －749.

5 Lindberg D，Akerstrom G，Westin G.Evaluation of CDKN2C/p18，CDKN1B/p27 and CDKN2B/p15 mRNA expression，and CpG methylation status in sporadic and MEN1－associated pancreatic endocrine tumours［J］.Clin Endocrinol(Oxf)，2008，68(2):271－277.

6 Auerkari EI.Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a)，p27(Kip1)and E － cadherin in carcinogenesis［J］.Oral Oncol，2006，42(1):5－13.

7 崔静，李庚，千新来.P27基因甲基化与结直肠癌发生发展及临床生物学行为的关系［J］.新医学，2005，36(3):145－147.

8 蔡瑜娇，杨桦，李鹏.p27基因启动子甲基化在乳腺癌中的研究［J］.重庆医学，2009，38(2):136－138.

9 王贺玲，张健，孙军.5－Aza－CdR对胃癌细胞系BGC823生长及p27kipl基因异常甲基化的影响 ［J］.山东医药，2008，48(1):120－121.