血管紧张素原基因启动子区A－20C和A－6G单核苷酸多态性与原发性高血压的相关性研究

龚洪涛，郭一力，杜凤和

原发性高血压是一种多基因病，其发病机制较为复杂，与遗传和环境等因素有关。肾素－血管紧张素系统是调节血压的主要环节之一，其中血管紧张素原 (Angiotensinogen，AGT)是该系统的惟一初始底物，AGT基因与原发性高血压的关系日益受到重视。有研究表明AGT基因启动子区、第二外显子以及启动子区变异与高血压之间存在关联，本研究选择AGT基因启动子区A－6G和A－20C两个位点，以原发性高血压病患者作为研究对象，探讨AGT基因A－6G和A－20C单核苷酸多态性与原发性高血压的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2005年6月—2007年1月于我院就诊的汉族高血压患者 (高血压组)200例，男90例，女110例，年龄35～77岁，平均 (53.7±10.6)岁。均符合1999年世界卫生组织/国际高血压协会诊断标准，收缩压≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和 (或)舒张压≥90 mm Hg。调查前2周内服用降压药者及以往曾被诊断为高血压者也被纳入高血压组，排除继发性高血压、严重心功能不全、严重肝肾功能障碍、3个月内有心肌梗死、脑卒中者及妊娠或哺乳妇女。选择我院同期就诊的汉族正常血压者 (对照者)192例，男98例，女94例，年龄 (51.6±8.1)岁。收缩压＜140 mm Hg，且舒张压＜90 mm Hg，均无服用降压药史、无高血压家族史，对照组人群的排除标准与高血压组的排除标准相同。

1.2 人体基本参数测定 测定身高、体质量、血压等，血压测量时静坐10 min，使用标准台式血压计连续测量3次，每次间隔 10 min，取其均值。以体质量/身高2计算体质指数(body mass index，BMI)。

1.3 生物化学指标测定 抽取空腹静脉血，离心取血清，采用生化分析仪检测空腹血糖、三酰甘油 (triglyceride，TG)、总胆固醇 (total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白胆固醇 (HDL－C)等指标。

1.4 DNA提取 取冷冻EDTA抗凝全血，水浴解冻，E.Z.N.ATM Blood DNA Kit(OMEGA)试剂盒提取 DNA，－20℃保存。

1.5 聚合酶链反应 (PCR) 扩增及限制性片断长度多态性(PFLP)AGT－20A/C PCR引物:上游引物序列:F5'－TAGTACCCAGAACAACGGCAG－3'，下游引物序列:R5'－GTCGCTTCTGGCATCTGTC－3'，AGT－6A/G PCR引物:上游引物序列:F5'－ACATCTGAGAGAGACAAGACCG－3'，下游引物序列:R5'－CTCAGGCG CACACACCTAG－3'。总反应体系为10μl，包括20 ng基因组 DNA 2.0μl，PCR引物 (5 pmol/L)各0.6μl，2×Taq PCR Master Mix 5μl，用灭菌蒸馏水补充至10μl。PCR反应参数:首先95℃变性10 min，随后进行35个循环，每一循环包括94℃变性30 s，分别在62℃和59℃退火30 s，72℃延伸40 s。最后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像仪成像。

分别取PCR扩增产物10μl，5 U Eco0109 I和BsiE I内切酶 (美国promega公司生产)，10 ENB缓冲液2μl，加双蒸水补足体积为20μl，37℃温育12 h后，取10μl上述产物，用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶在电压100 V，1×TAE缓冲液中电泳45 min，凝胶成像系统下观察并保存酶切结果。

1.6 统计学方法 应用SSPS11.5统计软件进行统计学分析。计量资料采用表示，计数资料用百分比表示。遗传平衡检验采用哈代－温伯格 (Hardy－Weinberg)平衡定律。两组间临床指标的比较采用u检验，计数资料的比较采用χ2检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较 高血压组与对照组的BMI和TC水平间差异有统计学意义 (p＜0.01，见表1)。

表1 高血压组和对照组临床资料比较Table 1 Comparison of clinic data between hypertension group and control group

2.2 AGT基因－20A/C和 －6A/G多态性 －20A/C位点PCR扩增产物为172 bp片段，若扩增片段中存在A－20C碱基替换，则产生限制性内切酶Eco0109 I位点 (RG/GNCCY)，AA基因型的扩增片段不存在Eco0109 I酶切位点，将出现一个172 bp片段;CC基因型存在Eco0109 I酶切位点，将出现126 bp和46 bp 2个片段;AC基因型则产生172 bp、126 bp和46 bp 3个片段。－6A/G位点PCR扩增产物为400 bp片段，若扩增片段中存在A－6G碱基替换，则产生限制性内切酶BsiE I位点 (CGRY/CG)，AA基因型的扩增片段不存在BsiE I酶切位点，将出现1个400 bp片段;GG基因型存在BsiE I酶切位点，将出现309 bp和91 bp两个片段;AG基因型则产生400 bp、309 bp和91 bp 3个片段。

2.3 AGT基因－20A/C和－6A/G多态性与高血压的关系AGT基因启动子区－20A/C和－6A/G的基因型频率在高血压组和对照组的分布均符合Hardy－Weinberg平衡 (P＞0.05)。说明达到了遗传平衡，具有群体代表性。两组－20A/C等位基因和基因型频率和－6A/G等位基因和基因型频率的分布间差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2、表3)。

表2 高血压组和对照组AGT－20A/C基因型和等位基因频率分布(例/频率)Table 2 Frequency of AGT－20A/C genotype and allele in hypertensiongroup and control group

表3 高血压组和正常对照组AGT－6A/G基因型和等位基因频率分布(例/频率)Table 3 Frequency of AGT－6A/G genotype and allele in hypertension group and control group

3 讨论

人AGT基因位于染色体1q42～43，全长约12 kb，由5个外显子和4个内含子组成，并且有两个重要调节结构:第1外显子上游区域的启动子和3'端侧面下游的增强子［1］。近年的研究表明，人类AGT基因核心启动子区域位于TATA框与转录起始位点之间;AGT基因核心启动子对AGT基因转录活性的调控，可能是AGT基因核心启动子区域上游的一个顺式作用元件hAG核心启动子元件1与转录因子AGT核心启动子结合因子1结合，通过与上游ALE序列和下游3'端增强子元件相互作用，影响基因的基础转录速率［2］。而该区域 (－6)位点A/G和 (－20)位点A/C等变异多态性均可影响基因的转录活性［3－4］，有研究表AGT基因A－20C和A－6G单核苷酸多态性与非洲裔美国人和高加索人群的原发性高血压有关［5］。Tiago等［3］研究了AGT基因启动子区域变异与高血压患者体质指数及动态血压的相关性，表明AGT基因核心启动子多态性显著影响高血压人群的体质指数和血压。但是，Hilgers等［6］报道在德国男性的AGT多态性研究中，A－6G等位基因和基因型以及A－20C变异在高血压病例组和对照组之间的分布无明显差异，对血压、肾脏血流量也无影响。另外一项关于A－6G多态性的大型研究涉及4个国家共4 322例研究对象，得出的结论是在任何一个人群中尚不能证明－6位点多态性与血压相关，认为此位点对血压调节的影响很小［7］。

本研究选择汉族高血压患者作为研究对象，发现AGT基因A－20C位点AA、AC、CC基因型频率及A－6G位点AA、AG、GG基因型频率在高血压组分别为0.80、0.17、0.03和0.56、0.41、0.03，与对照组比较，两组间差别无统计学意义，等位基因频率亦无明显差异。而国内杨春等［8］对藏族人群进行研究，结果表明高血压的发生与A－20C和A－6G多态性相关，在藏族高血压人群中AGT基因－20A、－6G等位基因发生频率较高，可能是藏族人群原发性高血压的遗传易感因子。李南方等［9］研究发现，基因A－6G变异虽然与哈萨克族人原发性高血压相关，但是A－20C变异可能与该族人群原发性高血压的发生无关。孔祥东等［10］对AGT基因的研究表明，A－6G突变在高血压和对照组间分布无明显差异，与本研究结果相近，因此我们考虑AGT基因A－20C和A－6G位点在高血压形成中起一定的作用，但在不同地区、不同种族及不同民族的人群中存在较大差异，并受其他一些因素的影响，同时由于本研究样本量的因素，因此有关结论有待于在更大规模的人群中进一步验证。AGT基因是高血压遗传易感性的主要候选基因之一［11］，因此进一步研究对于高血压高危人群的风险预测，以及指导临床预防、治疗等具有重要的理论意义及临床应用价值。

1 Dickson ME，Sigmund CD.Genetic basis of hypertension revisiting angiotensinogen［J］.Hypertension，2006，48(1):14－20.

2 Yanai K，Nibu Y，Murakami K，et al.A cis－ acting DNA element located between TATA box and transcription initiation site is critical in response to regulatory sequences in human angiotensinogen gene［J］.J Biol Chem，1996，271(27):15981－15986.

3 Tiago AD，Samani NJ，Candy GP，et al.Angiotensinogen gene promoter region variant modifies body size－ambulatory blood pressure relations in hypertension ［J］.Circulation，2002，106(12):1483 －1487.

4 Yanai K，Saito T，Hirota K，et al.Molecular variation of angiontensinogen core promoter element located between box and transcription in itiation site affects its transcriptty［J］.J Bio Chem，1997，272(48):30558－30568.

5 Markovic D，Tang X，Guruju M，et al.Association of angiotensinogen gene polymorphism and essential hypertension in African－Americans and Caucasians［J］.Hum Hered，2005，60(2):89 －96.

6 Hilgers KF，Delles C，Veelken R，et al.Angiotensinogen core promoter variants and non－modulating hypertension［J］.Hypertension，2001，38(6):1250－1254.

7 Province MA，Boerwinkle E，Chakravarti A，et al.Lack of association of the angiotensinogen－6 polymorphism with blood pressure levels in the comprehensive NHLBI family blood pressure program ［J］.J Hypertens，2000，18(7):867 －876.

8 杨春，邱长春，卢圣栋，等.血管紧张素原基因核心启动子区域突变与藏族原发性高血压的关联分析［J］.中华医学遗传学杂志，2000，17(3):149－152.

9 李南方，周玲，吴卫东，等.血管紧张素原基因5'端核心启动子区 (－6)A－G和 (－20)A－C变异与哈萨克族人原发性高血压相关性分析［J］.中华医学遗传学杂志，2004，21(1):23－28.

10 孔祥东，杨宇霞，张思仲，等.血管紧张素原基因和血管紧张素转换酶基因多态性与高血压［J］.中华心血管病杂志，2003，31(10):735－738.

11 杨月明，和姬苓.血管紧张素原基因多态性与我国高血压和脑卒中的关系［J］.中国全科医学，2008，11(2):262.