柴胡挥发油对大鼠肝能量代谢的影响

孙 蓉，杨 倩

(1.山东省中医药研究院药理学研究室，山东济南 250014;2.山东中医药大学，山东济南 250355)

柴胡挥发油(volatile oil from Bupleurum chinese)是柴胡的主要解热、抗炎活性成分，其制剂柴胡注射液和柴胡口服液在临床应用中却有大量不良反应报道，主要有过敏反应、急性肾衰竭、肺水肿和肝损害等［1－4］。据制备工艺分析，其不良反应的发生可能与其中所含的柴胡挥发油有关。大、小鼠ig给予一定剂量的柴胡挥发油，肉眼可见肝体积增大、色暗红、边缘变钝等大体病理学变化［5］。本实验室既往研究发现柴胡不同提取物均可造成大鼠肝毒性损伤，氧化应激损伤是其重要的损伤途径［6－8］。本课题研究表明，连续10 d ig给予大鼠柴胡挥发油0.25 ～0.50 ml·kg－1可造成大鼠明显肝毒性损伤，表现为血清谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)和谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)水平明显升高，体质量明显降低，肝体比值明显升高，并呈现明显的量-效关系，随给药剂量增加上述改变幅度增大［9］。氧化应激损伤也是柴胡挥发油肝毒性机制之一［9］，氧化应激与线粒体功能障碍密切相关，线粒体既是活性氧产生的主要部位又是活性氧攻击的首要靶点［10］。且越来越多的证据表明，在肝病变过程中伴随有线粒体功能和形态的改变［11］，本文旨在探讨柴胡挥发油对大鼠肝线粒体能量代谢的影响为阐明其肝毒性机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物

柴胡药材购自河北安国药材市场，经山东中医药大学生药学专家张芳鉴定为伞形科植物柴胡(B.chinese DC.)的干燥根，经检验为药典合格药材。

称取定量柴胡药材加12倍量水浸泡15 h，用挥发油提取装置加热回流提取5 h，收集挥发油(相当于生药量487.39 kg·L－1)置冰箱内备用。临用前加等量吐温80乳化后加蒸馏水配稀释至所需浓度。

1.2 试剂与试剂盒

Tris碱购自Sigma公司，其他试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。ATP测试盒(100T)，批号均为20080710，购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

DZTW型调温电热套，北京市永光明医疗仪器厂;T-9601 DDL-5低速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;UNICO2100紫外可见分光光度计美国尤尼柯(上海仪器有限公司);Clark氧电极，YSI Model 53氧气调节器，美国金泉(YSI);RF-510LC荧光分光光度计，日本岛津公司;JYD-IA型溶氧测定仪江苏江分电分析仪器有限公司。

1.4 动物给药及样品制备

SPF级Wistar大鼠，120只，雌雄各半，体质量140～190 g，由山东大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(鲁)20030004。稳定3 d后进入实验，分别 ig 给予 0.42，0.28，0.19 ml·kg－1的柴胡挥发油，连续 15 d，体积均为 10 ml·kg－1，正常对照组ig给予同体积的蒸馏水。

末次药后大鼠禁食12 h，眶静脉丛取血，3000×g离心10 min，处死解剖取肝脏。取1 g肝组织放入预冷的生理盐水中洗去污血，用小剪刀于冰浴的小烧杯中将肝组织剪成边长为1～2 mm的小块，加入5 ml预冷的分离介质(蔗糖 0.25 mo1·L－1，Tris-HCl 0.005 mol·L－1，EDTA 0.001 mol·L－1，pH 7.5)，将剪好的组织块转移到预冷的玻璃匀浆器中，上下均匀匀浆10次，匀浆液于4℃条件下12 000×g离心20 min，弃上清，取其沉淀部分即为线粒体，再加入150 μl匀浆递质，用微量匀浆器匀浆，制成线粒体悬浮液。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 肝脏线粒体呼吸耗氧、呼吸控制率、磷氧比值

采用 Clark 氧电极法［12］，取反应介质(蔗糖0.225 mol·L－1，KCl 15 mmol·L－1，KH2PO415 mmol·L－1，Tris-HCl 50 mmol·L－1，EDTA 1 mmol·L－1，pH 7.5)2.9 ml，加入搅拌反应杯中，恒温30℃。加入线粒体混悬液0.1 ml，以琥珀酸(终浓度 10 mmol·L－1)为底物，反应 1min 后加入 ADP 600 nmol·L－1，用 JYD-IA溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线，计算呼吸耗氧量、呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)和磷氧比值(phosphorus to oxygen index，P/O)。

1.5.2 ATP 含量［13］

将提取的完整线粒体混悬液按1∶1加裂解液混匀，保证线粒体膜可以被完全裂解。裂解后在4℃ 条件下12 000×g离心8 min，取上清，稀释100倍待测。ATP标准溶液用超纯水稀释成0，0.1，1，10和100 nmol·L－1浓度梯度，绘制标准曲线。加100 μl ATP 检测工作液到检测管中，在检测管中加10 μl样品，迅速用加样器混匀，立即用弱光仪检测，根据标准曲线计算出样品中的 ATP 含量，以μmol·g－1表示。

1.5.3 ATP 酶活力

定磷法［14］测定ATP酶活力，ATP酶的活力单位以每小时每克蛋白分解ATP产生的1 mmol无机磷的量来表示，即 mmol·h－1·g－1蛋白。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 柴胡挥发油对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响

与正常对照组比较，柴胡挥发油0.19，0.28和0.42 ml·kg－1组 RCR，P/O 和呼吸耗氧量均显著降低，且有随剂量增加不断降低的趋势(表1)。

表1 柴胡挥发油对大鼠肝线粒体耗氧量、呼吸抑制率(PCR)和磷与氧比值(P/O)的影响Tab.1 Effect of volatile oil from B.chinese on the respiratory oxygen uptake，respiratory control rate(PCR)and phosphorus to oxygen index(P/O)of hepatic mitochondrion in rats

2.2 柴胡挥发油对大鼠肝线粒体ATP含量的影响

与正常对照组比较，柴胡挥发油0.19，0.28和0.42 ml·kg－1组肝线粒体内 ATP 含量明显降低，并随剂量增加逐渐降低(P＜0.05)(表2)。

表2 柴胡挥发油对大鼠肝线粒体ATP含量的影响Tab.2 Effect of volatile oil from B.chinese on ATP contents in hepatic mitochondrion of rats

2.3 柴胡挥发油对大鼠肝线粒体ATP酶活性的影响

如表3所示，与正常对照组相比，柴胡挥发油0.19 ～ 0.42 mg·kg－1显著降低 Na+-K+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表3 柴胡挥发油对大鼠肝线粒体ATP酶活性的影响Tab.3 Effect of volatile oil from B.chinese on hepatic mitochondrion activities of ATPases in rats

3 讨论

肝是能量代谢的重要器官，含有丰富的线粒体，而线粒体是细胞有氧呼吸的基地和能量供应的场所，细胞生命活动约95%的能量来自线粒体。肝损伤时线粒体是较早发生损害的细胞器之一，线粒体的呼吸功能以及氧化磷酸化功能受抑制，ATP合成减少，从而必然引起细胞能量代谢障碍并最终导致细胞死亡。

RCR是指ADP控制下的氧消耗速率与不受ADP控制的氧消耗速率的比值，是反映线粒体结构完整性及氧化磷酸化耦联程度的灵敏指标［15］。P/O是指线粒体每消耗一摩尔氧原子时有多少摩尔的ADP磷酸化成ATP，反映了线粒体利用氧化释放的能量来合成ATP的效率［15］。ATP作为机体内各种生理活动最直接的供能物质，它的产生依赖于ATP酶的活性。Na+-K+-ATP酶是维持线粒体膜流动性正常的关键酶，Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质，Mg2+/Ca2+比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标［15］。本文研究结果表明，连续15 d给大鼠ig给予不同剂量的柴胡挥发油，肝线粒体PCR、P/O、呼吸耗氧量、ATP含量和ATP酶活性均明显降低。提示柴胡挥发油通过降低肝线粒体氧化磷酸化效率、减少ATP合成，从而使ATP酶功能不足，ATP酶活性降低致线粒体膜流动性降低、结构受损，从而造成肝细胞的不可逆损伤。

通过本研究可确认抑制肝线粒体呼吸功能、影响肝能量代谢是柴胡挥发油致大鼠肝毒性损伤的一条途径，因此，有必要对其可能存在的其他肝毒性机制进行研究，为阐明柴胡挥发油的肝毒性以及保证临床安全应用提供实验依据，同时也为中药肝毒性评价提供研究思路与技术支撑。

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