葛根素对糖尿病大鼠视网膜的保护及对NF-κB表达的抑制

陈 放，刘开扬，徐 珊，李伟红，李国立，张洪泉

(扬州大学1.临床医学院眼科，2.医药研究所，江苏扬州 225001)

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)严重且常见的微血管并发症之一。研究发现，糖尿病可导致几乎所有类型的视网膜神经细胞发生结构和功能的改变，神经元的凋亡、神经节细胞的丢失、胶质细胞的活化、神经微丝异常以及视神经逆向轴浆运输的减慢，这一系列改变均显示DR不仅是微血管病变，而且也是神经元病变，有时甚至在眼底荧光血管造影等检查尚未发现异常时，便出现视网膜神经元细胞的丢失［1］。核转录因子-κB(NF-κB)信号通路在DR发病中起重要作用。DM时多种因素导致氧化应激，激活NF-κB，启动下游基因转录，上调多种与DR有关的细胞因子、炎症因子、黏附分子的表达［2－4］。葛根素(puerarin)是从中药豆科葛属植物野葛〔Pueraria lobata(Willd.)Ohwi〕的根中提取的异黄酮类有效成分，化学名为8-β-D-吡喃葡萄糖-4'，7'-二羟基异黄酮苷。近几年研究表明，葛根素具有多种药理作用，包括降血脂、抗氧化、抑制低密度脂蛋白氧化修饰、清除活性氧自由基、调节一氧化氮合酶(NOS)活性使NO增高等［5－6］。陈娟等［7］研究发现，葛根素可显著提高缺血再灌注细胞的存活率，降低胱天蛋白酶3的活性而抑制细胞凋亡，发挥神经保护作用。遇颖等［8］从形态学上证实葛根素可改善DM大鼠的病理改变，对DR具有良好的治疗效果。本文采用DM大鼠模型，通过观察早期DM大鼠视网膜功能、超微结构的变化和NF-κB的表达及葛根素的干预作用，为中医药防治DM并发症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器

葛根素粉末为南京正大天晴制药公司提供，纯度99.8%，使用时用灭菌水配成混悬液;链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国 Sigma公司;NF-κB 检测试剂盒购自美国Santa Cruz公司;TUNEL检测试剂盒购自美国Roche公司。One Touch血糖仪及血糖试纸条为美国强生公司产品;视觉电生理检测仪为重庆康华公司产品;手术显微镜为苏州六六视觉公司产品;H-600型透射电子显微镜为日本日立公司产品。

1.2 动物、模型的建立与分组

清洁级雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK(浙)2008-0033，体质量200～230 g。除正常对照组10只SD大鼠除外，其余各组大鼠STZ诱导制备糖尿病大鼠模型。造模前大鼠禁食12 h，自由饮水。将STZ用pH为4.5的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液0.1 mmol·L－1配成 1%STZ 溶液，2 μm 过滤器过滤灭菌后，于大鼠左下腹单次ip给予STZ 60 mg·kg－1。72 h后取鼠尾血测血糖，并用尿糖试纸测尿糖。随机血糖浓度≥16.65 mmol·L－1，尿糖 ++ ～ +++ 者即为糖尿病大鼠。同龄正常大鼠同期给予pH为4.5的枸橼酸缓冲液 0.5 ml，48 h后测量血糖 ＜5.6 mmol·L－1确定为正常对照组。DM大鼠再随机分为DM模型组、葛根素 125，250和 500 mg·kg－1治疗组。葛根素用灭菌水制成混悬液ig给予大鼠，每日1次，连续给药4周。

1.3 视网膜电图(electroretinogram，ERG)的测定

分别于造模前及实验结束处死前测定闪光ERG。大鼠暗适应30 min，ip给予3%戊巴比妥钠40 mg·kg－1麻醉后，0.5% 托吡卡胺/去氧肾上腺素散瞳，参考电极置于两眼连线中点皮下，接地电极刺入耳尖皮下。操作时白光闪耀，反应持续200 ms，光强度10 cd·s－1·m－2，单次反应。记录暗适应眼最大反应的b波振幅。

1.4 电子显微镜标本的制作及观察

大鼠 ip给予3%戊巴比妥钠40 mg·kg－1麻醉后，摘除双眼眼球。一眼球2.5%中性戊二醛溶液固定12 h以上，取水平眼球赤道后视网膜组织1 mm ×3 mm，PBS 1 mol·L－130 min，中间换液 2 次。放入1%的四氧化锇缓冲液固定2 h，PBS冲洗3次，逐级乙醇脱水，环氧树脂包埋。切1 μm的半薄切片作光镜定位，然后做超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色。透射电镜观察视网膜超微结构。

1.5 TUNEL法检测凋亡细胞

将上述摘除的另一眼球用4%多聚甲醛溶液固定2 h，剔去角膜、晶状体制成眼杯，固定4～6 h后取出眼杯依次梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片。石蜡切片常规脱蜡，乙醇梯度水化，用含2%H2O2的PBS于室温反应5 min，PBS冲洗5 min，切片上滴加54 μl末端核酸转移酶缓冲液，置室温1～5 min，于湿盒中孵育1 h，滴加54 μl过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30 min。链霉亲和素-生物素(SABC)法染色，二氨基联苯胺(DAB)显色，蒸馏水冲洗4次，每次冲洗5 min，苏木素复染、脱水、透明后封片。以光学显微镜下细胞核或细胞浆呈黄色或棕黄色染色为TUNEL阳性表达。每张切片随机选取5个高倍视野，对阳性细胞进行计数，得到平均阳性细胞数，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。AI(%)=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.6 免疫组化染色法检测视网膜组织NF-κB p65活性

石蜡切片常规脱蜡，PBS 0.1 mol·L－1浸泡 5 min，抗原修复(PBS 0.1 mol·L－1预热至 92 ～98℃，放入玻片，加热 5 min，自然冷却至室温)，PBS 0.1 mol·L－1冲洗5 min，3%过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，10%正常山羊血清的PBS 0.1 mol·L－1pH 7.4 稀释，封闭游离的结合位点，减少非特异性染色，室温孵育15 min，倾去，分别滴加1∶20稀释的NF-κB p65单克隆一抗，阴性对照组用PBS代替一抗，4℃过夜。PBS 0.1 mol·L－1冲洗 5 min，滴加生物素标记的二抗 IgG，37℃孵育 15 min，PBS 0.1 mol·L－1冲洗5 min，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育 15 min，PBS 0.1 mol·L－1冲洗 5 min，SABC法染色，DAB显色，自来水冲洗5 min，苏木素复染后封片。以光学显微镜下细胞核呈棕黄色或棕褐色染色为NF-κB p65阳性表达细胞。NF-κB p65活性(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 葛根素对糖尿病大鼠视网膜电图的影响

造模前各组大鼠ERG的b波振幅的差异无统计学意义。如表1所示，与正常对照组相比，DM模型组大鼠ERG的b波振幅明显降低(P＜0.05)，与DM模型对照组相比，葛根素250和500 mg·kg－1组显著上升(P ＜0.05)(表1)。

表1 葛根素对糖尿病大鼠视网膜电图(ERG)的b波振幅的影响Tab.1 Effect of puerarin on b wave amplitude of the electroretinogram(ERG)of diabetic mellitus(DM)rats

2.2 葛根素对糖尿病大鼠视网膜超微结构的影响

在透射电镜下可见，正常对照组视网膜各层结构清晰，细胞排列整齐，细胞核和细胞器正常，未出现明显的空泡样变性(图1A)。DM对照组视网膜出现大量的空泡变性，外节膜盘结构模糊，排列紊乱，肿胀变性。内、外核层细胞内线粒体肿胀，大量空泡样变性(图1B)。葛根素125和250 mg·kg－1组外节膜盘间隙较DM组缩小，排列平行度好转，内外核层细胞线粒体空泡变性减少(图1C，D)。葛根素150 mg·kg－1组视网膜超微结构仅有少量线粒体肿胀，与正常对照组差异不大(图1E)。DM模型组可见，神经节细胞层线粒体肿胀，线粒体嵴丢失，细胞核皱缩，核膜不连续、断裂(图2B)。葛根素125和250 mg·kg－1组外节神经节细胞线粒体空泡样变性的比例下降，线粒体仍有肿胀(图2C，D)。葛根素500 mg·kg－1组视网膜在透射电镜下可见节细胞排列紧密，未出现明显的空泡变性，线粒体肿胀明显好转(图2E)。

2.3 葛根素对糖尿病大鼠视网膜凋亡及 NF-κB p65活性影响

如表2和图3所示，正常对照组细胞凋亡少，偶见神经节细胞和内核层细胞有染色阳性细胞。与正常对照组相比，DM模型组视网膜细胞凋亡指数显著增高(P＜0.05)，主要发生在神经节细胞层和内核层细胞。葛根素干预后各组凋亡指数均显著下降(P＜0.05)。如表2和图4所示，正常对照组大鼠视网膜组织基本无NF-κB p65蛋白阳性表达。DM模型对照组视网膜 NF-κB p65表达明显增强(P＜0.05)，可见于视网膜神经节细胞层、内核层及外核层。葛根素干预后视网膜NF-κB p65表达有所下降，其中葛根素250和500 mg·kg－1组与DM模型组显示统计学意义差异(P＜0.05)。

表2 葛根素对DM大鼠视网膜组织细胞凋亡指数及NF-κB p65活性影响Tab.2 Effect of puerarin on NF-κB activity and apoptoic index in the rat retina

图1 葛根素对糖尿病(DM)大鼠视网膜超微结构的影响 (×9700).动物分组及给药方法见表1.动物给药4周后取视网膜组织切片检查.A:正常对照组;B:模型组;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1组.Fig.1 Effect of puerarin on retinal ultrastructure of rats(×9700)

图2 葛根素对糖尿病(DM)大鼠视网膜神经节细胞层的影响.动物分组及给药见表1.A:正常对照组;B:模型组;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1组.Fig.2 Effect of puerarin on the retinal ganglion cell layer in DM rats.

图3 葛根素对DM大鼠视网膜细胞凋亡的影响 (DAB×400).动物分组及给药见图1.A:正常对照组;B:模型组;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1组.黄色或棕黄色为阳性细胞.Fig.3 Effect of puerarin on retinal apoptosis in DM rats by TUNEL(DAB ×400).

图4 葛根素对DM大鼠视网膜组织NF-κB p65活性的影响 (DAB×400).动物分组及给药见表1.A:正常对照组;B:模型组;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1组.棕黄色或棕褐色为阳性细胞.Fig.4 Effect of puerarin on retinal NF-κB p65 activity in DM rats(DAB ×400).

3 讨论

本研究通过对 DM大鼠 ERG、透射电镜及TUNEL观察发现DM大鼠出现神经视网膜的改变。b波起源于外层视网膜，比较稳定，主要反映视网膜神经节细胞以前的视网膜神经细胞的功能状态。Li等［9］报道STZ诱导的DM大鼠成模后2周就可发生b波的振幅下降，而DM大鼠模型至少3个月左右才出现血管改变。本研究中成模后4周的DM大鼠b波振幅较正常对照组已有显著下降，说明DM早期视网膜就发生了神经细胞功能损害。动物实验表明，发生DM 1个月时电镜可观察到视网膜神经元的超微结构出现病理学变化，包括线粒体肿胀，线粒体嵴丢失，胞浆空泡化、核膜不完整、核破碎等，而视网膜微血管的基底膜和内皮细胞未出现明显异常改变［10］。本研究中透射电镜的观察结果亦显示造模4周的DM大鼠神经节细胞，内、外核层细胞已出现明显的改变，而毛细血管的改变则不明显。TUNEL法发现在早期DM大鼠的视网膜就已发生凋亡，神经节细胞层凋亡细胞的数目比对照组明显增加，而且内、外核层均见阳性细胞。

本研究中，b波振幅明显升高。视网膜神经细胞的超微结构明显好转，视网膜病理损害逐渐减弱，视网膜神经细胞的凋亡指数显著下降，说明葛根素对早期DM大鼠的神经视网膜具有一定保护作用。

目前已证实，在DM状态下视网膜氧化应激加剧，高血糖和氧化应激的主要靶点是NF-κB，并通过其调控与炎症、细胞增生和细胞分化等密切相关的多种基因的表达，促进细胞凋亡和新生血管的生成。Romeo等［3］研究认为视网膜神经节细胞在DM早期即出现NF-κB活化，说明缺氧诱导了NF-κB活化。NF-κB被高血糖激活后，可控制视网膜周细胞的凋亡，并介导单核细胞与血管内皮的黏附性增加，从而导致视网膜血管的硬化，加重DM视网膜血管的病变，造成视网膜组织的缺血缺氧。在DM患者的玻璃体和视网膜毛细血管中NF-κB活性比非DM患者增强，NF-κB活性增强与周细胞的丧失和无细胞血管的发生成正相关［4］。

本研究结果显示，DM组视网膜NF-κB p65表达较正常对照组明显增强，以神经节细胞为主，内外核层细胞均有存在。提示葛根素减轻DM大鼠神经视网膜的损伤在一定程度上可能是因为抑制了DM引起的视网膜中NF-κB的激活，而NF-κB得以活化与DM大鼠视网膜中氧自由基的产生有关。但其具体的信号传导通路有待于进一步的研究。

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