6株溶磷菌和4株固氮菌混合培养条件的研究

刘青海，姚 拓，马 从，李显刚

（甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070）

早在20世纪1925年就有学者发现不同菌株组合混合培养可以形成不同的产物。研究认为混合培养能减少或避免纯培养过程中生物活性下降的现象，增加培养菌生物量［1］，可以获得更多的菌株性质。陶光灿等［2］研究了细菌组合的固氮，解磷与不同培养条件以及混合培养的研究表明，微生物之间存在着协同作用，这是一个潜能巨大的新的微生物资源，正在逐渐成为新的研究热点。常慧萍等［3］对小麦根际的解磷菌、解钾菌和固氮菌进行了互作研究发现：当两菌株混合后，解磷菌P1616可以促进固氮菌N2106－L生长，提高了混合菌悬液中的细胞密度，解磷菌P1616还可以促进解钾菌KL0405的生长。

温度，pH和盐分浓度对菌体生长影响很大，在微生物发酵的过程中要严格控制温度，pH和盐分浓度才能有最大的有效活菌数［4］。溶磷菌和固氮菌混合对温度、pH和盐分浓度等环境因素的响应不同，本研究旨在确定混合菌株对环境因子的适应范围，为后续溶磷菌和固氮菌混合菌剂研制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

供试菌株为甘肃农业大学草地微生物多样性实验室提供的6株溶磷菌，4株固氮菌（表1）（3株联合固氮菌和1株根瘤菌）。

表1 供试菌株及来源Table 1 List and source of tested strain

1.2 菌株间拮抗反应

分别将活化后的菌株两两相交划线接种在LB平板培养基上，28℃培养2～3d，每天观察交叉点处细菌生长状况，若交叉点两细菌生长弱或不生长，说明两菌株间有拮抗作用，不适合混在一起做复合菌肥；若交叉点细菌生长良好，则说明两菌株可以共存，之间没有抑制作用，不发生拮抗反应的各菌株可以混合培养，可以做复合菌肥。

1.3 菌液的制备

将各供试菌株划线接种于LB固体斜面上，28℃下培养24h，加灭菌水制成菌悬液，用UV－721紫外分光度计在D660nm下测定菌悬液浓度，并用无菌水调节D值一致后，备用。

1.4 菌株处理组合

A组 6株溶磷菌单独培养（共计6个处理）；B组6株溶磷菌和4株固氮菌两两组合（共计24个处理）。

1.5 温度条件对菌株生长的影响

（1）将LB液体培养基分装至试管中，每管5mL，121℃灭菌30min，备用。

（2）将菌株按0.1mL接种量接种到液体试管培养基，组合菌每个菌接种0.05mL，每个菌种组合接种3管，分别标上10、15、20、25、30、35、40、45℃标记。

（3）按标记，将各试管置于相应温度的振荡培养箱中培养48h。

（4）取出观察各菌株的生长情况，测定每个菌株的D660nm吸光值，并计算平均值，以确定各菌株的最适生长温度。

1.6 初始pH对菌株生长的影响

（1）配置LB液体培养基，分装为11份，分别采用1mol/L的NaOH和1mol/L的 HCl依次调节pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，再将LB液体培养基分装至试管中，每管5mL，分别标上pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0标记，121℃灭菌30min，备用。

（2）将菌株菌悬液按0.1mL（单菌株）接种量接种到液体试管培养基，组合菌每个菌接种菌悬液0.05 mL（菌株组合），每个组合接种3管。

（3）将标记好的菌株置于28℃振荡培养箱中培养48h，转速为180r/min。

（4）取出观察各菌株的生长情况，并测定其D660nm的平均吸光值，确定菌株及组合的最适生长pH。

1.7 盐分对菌株生长影响

在LB培养基中加入NaCl配成1%、3%、5%、7%、9%5个浓度梯度，灭菌后制成平板备用。将配好的各处理菌悬液以划线法接种于各盐浓度的LB固体培养基上，每个处理3个重复，以不接种的为对照，置28℃下培养7d，观察菌体生长情况。

2 结果与分析

2.1 拮抗测定

拮抗试验是鉴定菌株间菌株菌能否共存的传统方法，6株溶磷菌和4株固氮菌之间均无拮抗反应发生，各菌种可以混合培养。

2.2 温度对菌体生长的影响

由图1～6可以看出，温度对单菌株和混合菌的影响较大，各供试菌株在10～45℃均能生长，但差异较显著；各菌株或菌株组合从10～45℃的D660nm值先增加，到25℃或30℃时到达峰值，随后开始下降，25～35℃是最佳培养温度。

在图1溶磷菌Jm170和根瘤菌S11组合接种在各温度D660nm值低于单菌株Jm170和Jm170与其他固氮菌组合。在图2～6中，Jx59＋G组合在10～45℃范围内D660nm值均高Jx59与其他固氮菌和根瘤菌的组合，当30℃时到达峰值，为1.125；溶磷菌Lx81、Lx191、Jm92、Lx22与固氮菌和根瘤菌的组合的D660nm值在25～45℃均显著高于Lx81单独接菌时的D660nm值；在图5，6中，Jm92＋W5和Lx22＋G是较优菌株组合，在10～45℃D660nm值均高于其他组合，在10℃或45℃的条件下均能正常生活，Jm92＋W5在10℃和45℃条件下的D660nm值分别为0.268和0.278，Lx22＋G在10℃和45℃条件下的D660nm值分别为0.315和0.307，菌体数量较多，可以适应高温或低温的不良环境。

2.3 初始pH对菌体生长的影响

从图7～12可看出，pH对单一菌株和混合菌的生长影响较大，无论单一菌株或混合菌在pH＜4或＞9的培养液中生长缓慢或不生长，pH在6.0～8.0，大部分菌或菌株组合都可以良好生长，当pH为8.5时，Lx191＋G和Lx191＋S11生长最好，D660nm值分别为0.475、0.429。可以适应较为碱性的土壤。

图7中Jm170＋W5组合和Jm170＋G组合在pH为4.5～8.5的D660nm值显著＞Jm170单独培养时的D660nm值，Jm170和Jm170＋W5在pH为7.5时同时到达峰值，在峰值差异明显，分别为0.482、0.728。在图8中，Jx59是在pH为6.5时D660nm值达到峰值，而Jx59与固氮菌的组合在pH为7.5时D660nm值达到峰值。在图10中，Lx81＋G在pH为6.5和7.5是D660nm值出现2个峰值，D660nm值分别0.655和0.705，均较Lx81在pH为6.5和7.5时的D660nm值0.369和0.512高。在图10中，Lx191＋G、Lx191＋W5和Lx191＋N4等组合在pH 6.0～8.5的D660nm值显著高于Lx191单独培养时的D660nm值。在图11中，Jm92＋S11组合在pH为8.0时D660nm值出现峰值，说明组合菌在碱性环境生长更良好。在图12中，pH在6.0～8.0时，溶磷菌Lx22与固氮菌的组合D660nm值显著高于溶磷菌单独培养时D660nm值。图7～12中，pH在6.0～8.0绝大多数菌和菌株组合生长良好，菌株互作可以促进菌株的生长和繁殖。由于各菌株组合在偏碱性环境可以良好生长，可以适应北方的碱性的土壤，为菌肥的开发提高有利条件。

图1 温度对溶磷菌Jm170和固氮菌组合生长的影响Fig.1 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jm170）and NFB

图2 温度对溶磷菌Jx59和固氮菌组合生长的影响Fig.2 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jx59）and NFB

图3 温度对溶磷菌Lx81和固氮菌组合生长的影响Fig.3 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx81）and NFB

图4 温度对溶磷菌Lx191和固氮菌组合生长的影响Fig.4 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx191）and NFB

图5 温度对溶磷菌Jm92和固氮菌组合生长的影响Fig.5 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jm92）and NFB

图6 温度对溶磷菌Lx22和固氮菌组合生长的影响Fig.6 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx22）and NFB

图7 pH对溶磷菌Jm170和固氮菌组合生长的影响Fig.7 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jm170）and NFB

图8 pH对溶磷菌Jx59和固氮菌组合生长的影响Fig.8 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jx59）and NFB

图9 pH对溶磷菌Lx81和固氮菌组合生长的影响Fig.9 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx81）and NFB

图10 pH对溶磷菌Lx191和固氮菌组合生长的影响Fig.10 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx191）and NFB

图11 pH对溶磷菌Jm92和固氮菌组合生长的影响Fig.11 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jm92）and NFB

图12 pH对溶磷菌Lx22和固氮菌组合生长的影响Fig.12 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx22）and NFB

2.4 盐分对细菌生长的影响

试验结果显示，不论单一菌株还是菌株组合均能在1%NaCl的培养基上生长良好，随盐分浓度的升高，菌株及菌株组合或能生长或生长一般或生长良好。但在9%NaCl浓度下，各处理均不能生长。在3%NaCl浓度下，溶磷菌只有Lx81能良好生长，其他菌都生长一般，菌株组合中Jm170＋W5、Jx59＋W5、Jx59＋G、Lx81＋W5、Lx81＋G、Lx191＋W5、Jm92＋N4和Lx22＋G等7个组合能生长良好，比单一菌株生长好。在5%NaCl浓度下，组合中只有Lx191＋W5能良好生长，而Jm170＋S11、Jx59＋N4、Jm92、Lx22＋S11不能生长，Jm170、Jm170＋W5、Lx81、Lx81＋G、Lx191＋G生长一般，其他菌株组合生长较差。在7%NaCl浓度下，单一菌株中只有Jm170、Jx59生长较差，其他单一菌株均不能生长，而组合菌中Lx81＋W5、Lx191＋W5、Jm92＋W5生长一般，Jm170＋W5、Jm170＋N4、Lx81＋N4、Lx81＋G、Jm92＋N4、Jm92＋G、Lx22＋W5、Lx22＋G可以生长，比它们单独培养耐盐性强。菌株互作可以促生菌的耐盐性，大部分菌株组合都可以耐受7%NaCl浓度，有较强的耐盐性，对甘肃盐碱性土壤条件具有一定的适应性，有利于开发适宜甘肃省的微生物促生菌剂（表2）。

表2 不同盐分浓度对各菌株及其组合生长的影响Table 2 The effect of different salt concentrations on strains and combinations

3 讨论与结论

3.1 温度条件对菌株生长的影响

温度是影响生物有机体生长和存活最重要的因素，它可以从不同的方面对生物体内所进行的许多生物化学反应产生影响［5］，溶磷菌与固氮菌或根瘤菌混合培养后在5～45℃均可正常有活，菌株组合Jm92＋W5，Jm92＋N4、Jm92＋S11和Jm92＋G在任何温度下D660nm值都显著高于Jm92单独培养时D660nm值，菌株组合可以提高培养液中的活菌数，尤其是溶磷菌和固氮菌或根瘤菌组合表现的尤为突出，固氮菌或根瘤菌能固定空气中的氮，可以提高溶液的含氮量，为溶磷菌生长提供更多的氮素，溶磷菌与固氮菌组合可能分泌一些激素来促进他们各自的生长。温度主要影响菌株体内酶的活性，在低温时，酶活性较低，酶促反应也较缓慢，利用营养物质能力也较弱，从而影响细菌的生长，随着温度的升高，酶活性也逐渐升高，酶促反应也较快，加快了对营养物质的利用率、细菌的分化速度，从而提供了培养液中的活菌数，但温度上升到一定程度，如超过35℃时，许多酶逐渐失活，酶促反应也开始降低，降低了对营养物质的利用率，细菌数量大量减少，当超过45℃时，大批的酶失活，菌体不能利用溶液中的营养物质，从而细菌大批死亡，溶液中的细菌数量达到最低值；温度还会通过影响发酵液的理化性质，间接影响菌体生长［6，7］。许多研究表明，细菌的温度培养控制在28～30℃比较适合［8］，但试验发现，溶磷菌与固氮菌或根瘤菌组合培养时，温度在25～35℃，培养液的菌数均可达到较高水平，从而放宽了菌肥发酵时的温度范围，为菌肥的生产提供理论依据。

3.2 初始pH对菌株生长的影响

培养液中不同初始pH对菌体产量影响较大，在pH＞4或＜9的培养液中均不能正常生长，培养液中的pH将影响到细菌对代谢产物的解离，引起细胞膜电荷变化，从而影响对营养物质的吸收利用，pH还影响细菌体内酶的合成，进而影响细菌对营养物质的分解利用［9］。pH过高或过低都不利于细菌的生长和代谢物质的产生，进而影响到溶磷菌、固氮菌的溶磷能力、产激素能力和固氮能力。钟传青［10］发现，培养时pH在7～8菌体数最多，当pH低于7或高于8时，菌体产量下降，因此，初始pH值在7～8较适合。汤春梅等［4］发现燕麦或小麦根际促生菌在中性或偏碱的条件下生长好，178、O－6、N4和X5对碱性环境适应性很强。胡子全等［11］发现一株有机磷细菌最适初始pH为8.0～9.0，在初始pH为5.5～10.0内时，pH对有机磷细菌生长影响不显著。

试验发现混合菌均较单一菌对pH值的耐受范围大，Jm92＋G在初始pH为5.0～8.5菌能正常生长，活菌数较多，可以适应偏碱或偏酸的环境，提高了菌肥的生态适应性，混合菌对pH适应范围增大，可能是由于产酸菌或产碱菌的存在，所产的酸或碱缓冲了溶液pH对菌体的伤害，从而增大了对pH的适应范围。试验溶磷菌和固氮菌组合，无论单一菌或混合菌均能在pH为8的碱性环境正常生长，可以适应北方盐碱性的土壤，这为菌肥的开发提供了有利条件。

3.3 盐分对菌株生长的影响

Na＋和Cl－是维持细胞外液渗透压的主要离子；在细胞外液的阳离子总量中，Na＋占90%以上，在阴离子总量中，Cl－占70%。所以，NaCl在维持渗透压方面起着重要作用。Na＋与细胞膜成分发生特异作用而增强了膜的机械强度，有利于细胞膜结构的稳定。高盐条件下，引起菌体细胞壁和细胞质中的核质都变的更紧密，多核糖体的比例不断上升［11］。不同的NaCl浓度下，细菌中的细胞脂肪酸的组成也不同，高盐浓度下，细胞的脂肪酸含量不断上升，达到一定浓度不再上升，当盐浓度继续增加时，细菌细胞便会发生质壁分离，细菌细胞脱水死亡［13］。

细菌的耐盐机理较复杂，大部分人认为细菌可以合成或积累一些所谓“亲合性溶质”的有机化合物，如甘油、单糖、氨基酸及其衍生物等小分子极性物质来平衡细胞内外的渗透压，保护由于脱水而变性的蛋白质［14］。这些亲和性有机化合物在细菌体内迅速合成和分解，对于不同的盐环境有很好的适应作用。

在低盐浓度下，各菌株和菌株组合都能良好生长，当7%NaCl浓度下，Jm170、Jx59、W5生长较差，而组合菌株中，Lx81＋W5、Lx191＋W5、Jm92＋W5生长一般，Jm170＋W5、Jm170＋N4、Lx81＋N4、Lx81＋G、Jm92＋N4、Jm92＋G可以生长，较单独培养菌株耐盐性强。混合培养耐盐性增强可能是由于两菌株混合（溶磷菌和固氮菌）能够使小分子极性物质，如甘油、单糖、氨基酸抵抗高浓度盐对细胞的损伤，可以从细胞外高盐环境中获取更多的水分，从而混合菌具有更强的耐盐性，具体机理还有待进一步研究。组合菌的耐盐性对西北地区盐碱性土壤有一定适应性，对于开发适宜西北地区的PGPR混合菌肥有重要意义。

溶磷菌和固氮菌单独培养或混合培养最适温度在25～35℃，混合培养较单独培养生长良好；溶磷菌和固氮菌单独培养或混合培养最适pH在6.5～7.5，在pH 7.5～8.5偏碱性环境下，混合培养生长较好，较单独培养耐碱性更强；菌株Lx81＋W5组合，Lx191＋W5组合和Jm92＋W5组合可以在7%的盐浓度下正常生长，较单独培养表现出更强的耐盐性。

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