酶解辅助乙醇法提取土茯苓总黄酮条件研究

任倩 李志平* 杨朝霞 朱晓妮

（吉首大学化学化工学院 湖南吉首 416000）

土茯苓为百合科植物光叶菝葜的干燥根茎，主要产于华中、华南地区。味甘、淡，性平，具有解毒散结、祛风通络、利湿泄浊的作用，主治喉痹、痈疽恶疮、瘰疠、癌瘤、筋骨挛痛、水肿、淋浊、泄泻、脚气、湿疹疥癣、汞中毒。土茯苓含有多糖类、有机酸类、苯丙素类、黄酮及黄酮苷类、甾醇类、皂苷类及挥发油等多种化学成分。其中具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视[1~5]。

纤维素酶解辅助提取黄酮是较新的方法。湘西地区盛产土茯苓，本文拟采用植物纤维素酶解辅助乙醇法，对土茯苓中总黄酮的提取条件进行研究，为湘西地区土茯苓的开发利用提供理论和实践依据。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 实验仪器

TC-15套式恒温箱（海宁市新华医疗器械厂）；DHG-924A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密试验设备有限公司）；TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）；AY220型托盘电子分析天平（岛津）；电子天平（中国凯丰集团）；HH S21-4--S电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；PHS-4A实验室PH计；SHB-3循环真空泵（上海申生科技有限公司）；SENCOR系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）。

1.1.2 实验试剂

土茯苓（湖南省吉首市某药厂提供），YZ7-601植物提取复合酶（湖南尤特尔生化有限公司），95%乙醇（湖南汇虹试剂有限公司），芦丁标准品（不小于98.0%，中国药品生物制品检定所）；硝酸钠、氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司）、硝酸铝（天津市大茂化学试剂厂）（均为分析纯，不需处理直接使用）；去离子水。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品21.5 mg，用30%的乙醇溶解完全后，移入100mL容量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，即得芦丁标准溶液。分别精密吸取上述芦丁标准液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、16.0、32.0mL于50mL容量瓶中，按徐雅琴等人的方法显色测定[6,7]，用紫外-可见光分光光度计测定510nm处吸光度。

以芦丁浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归，得回归曲线方程y=9.2283x+0.0139，R2=0.9987。

1.2.2 土茯苓总黄酮的提取方法

将采集的土茯苓自然晒干，用切片机切片，切片自然晒干，得土茯苓干片，备用。

准确称取一定质量的土茯苓干片，置于三角烧瓶中，加入一定体积的乙醇和一定质量的植物植物复合酶，调节水溶液pH值为一定值，在48℃水浴锅中恒温加热，酶解一定时间，加入70%乙醇200mL，水浴锅升温至88℃，恒温灭酶10min。冷却，改为回流装置，水浴加热回流2h，提取液冷却、过滤，滤液定容。取一定体积定溶液，用铝离子显色、紫外-可见分光光度法测定总黄酮浓度，计算总黄酮提取率。

1.2.3 土茯苓总黄酮测定方法

总黄酮提取液于250mL容量瓶中加入70%乙醇定容，摇匀。取2.0mL定容液于25mL容量瓶中，按徐雅琴等人的方法配置显色溶液，用紫外-可见分光光度计测定其510.0nm处的吸光度，根据标准曲线回归方程计算提取液总黄酮浓度，并按以下公式计算总黄酮提取率。

总黄酮提取率（%）=样品中总黄酮质量/样品质量×100%

提取液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至粘稠状，粘稠物转移至蒸发皿，放入真空恒温干燥箱中一定温度和压力下恒温干燥至恒重，粉碎得棕黄色粉末，即为土茯苓粗提物干粉，称量。分别按下述公式计算干粉得率和干粉中总黄酮含量。

干粉得率(%) =干粉质量/样品质量 × 100%

干粉总黄酮含量(%) =干粉中总黄酮质量 / 干粉质量 × 100%

1.2.4 最佳提取条件实验方法

对影响总黄酮提取率的主要因素酶添加量、酶解时间、pH值等3个因素进行单因素实验，探讨最佳提取条件，最佳提取条件通过重复实验加以验证[8~10]。

1.2.4.1 酶添加量对总黄酮提取率影响

准确称取土茯苓干片6份，各30.0g，分别加入具塞锥形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再加入不同质量的植物复合酶，使酶浓度为0%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、3.0%，控制温度48℃，调节酶解介质pH为4.8，酶解3.0h后，置于水浴锅内升至88℃，保持恒温灭酶10min。加入200mL、70%的乙醇，回流2h，减压抽滤，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。取一定体积定溶液，用铝离子显色、紫外-可见光分光光度计测定总黄酮浓度，计算总黄酮提取率。考察酶添加量对土茯苓总黄酮提取率的影响。

1.2.4.2 酶解时间对总黄酮提取率影响

准确称取土茯苓干片6份，各30.0g，分别加入具塞锥形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再按土茯苓干片质量各加入1.0%的植物复合酶，调节酶解介质pH为4.8，置于48℃水浴锅中，分别酶解0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h，酶解液升至88℃，保持恒温灭酶10min。加入200mL、70%乙醇，回流2h，减压抽滤，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，取一定体积定溶液，用铝离子显色、紫外-可见分光光度法测定总黄酮浓度，计算总黄酮提取率。考察酶解时间对土茯苓总黄酮提取率的影响。

1.2.4.3 pH值对总黄酮提取率影响

准确称取土茯苓干片6份，各30.0g，分别加入具塞锥形瓶中，各加入90mL 70%乙醇水溶液。再按土茯苓干片质量各加入1.0%的植物复合酶，酶解时间为3h，置于48℃水浴锅中，分别调节酶解介质pH为4.0、4.5、4.5、5.0、6.0，水浴锅内升至88℃，保持恒温灭酶10min。加入200mL、70%的乙醇，回流2h，减压抽滤，置于250mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，取一定体积定溶液，用铝离子显色、紫外-可见分光光度法测定总黄酮浓度，计算总黄酮提取率。考察pH值对土茯苓总黄酮提取率的影响。

2 结果与讨论

2.1 植物复合酶酶解条件单因素实验结果

2.1.1 酶浓度对总黄酮提取率影响

酶添加量对土茯苓总黄酮提取率的影响结果见图1。

从图1可以看出，酶的含量超过一定范围时，黄酮类物质的提取率反而下降，在1.0%时总黄酮得率达到最大值，继续增大酶浓度，总黄酮得率反而逐渐下降，原因有待进一步研究。

2.1.2 酶解时间对土茯苓黄酮提取率影响

酶解时间对土茯苓总黄酮提取率的影响结果见图2。

从图2可以看出，酶解时间增加，总黄酮提取率逐步增加达到一定值后逐渐趋于不变，当酶解时间达到2.0h时黄酮的提取率趋于不变。

2.1.3 pH值对土茯苓黄酮提取结果影响

PH值对土茯苓总黄酮提取率的影响结果见图3。

由图3可以看出：在介质pH为4.5到5.0，总黄酮得率增加，在pH=5.0时达到最高，当pH为5.5时总黄酮提取率降低。其原因可能是酶活性受介质pH的影响，pH值不仅影响酶的构象，而且也影响底物的解离状态。

2.2 最佳提取条件重复实验

由单因素实验得出酶解辅助法提取土茯苓总黄酮的最佳提取条件为：酶添加量1.0%，酶解时间3.0h，pH值5.0。

最佳提取条件进行3次重复实验结果见表1：

实验结果表明，单因素实验中各影响因素的最佳条件组合重现性良好。最佳条件下，粗提物干粉得率13.9%，干粉中总黄酮含量4.0%，总黄酮提取率为0.53 %。

3 结论

酶解辅助乙醇法提取土茯苓总黄酮的最佳条件为：酶浓度1.0%，酶解时间3.0h，酶解介质pH为5.0；最佳条件下，粗提物干粉得率13.9%，干粉中总黄酮含量4.0%，总黄酮提取率为0.53 %。

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