高效液相色谱法测定金叶接骨木中熊果酸和齐墩果酸的含量

赵淑红， 高亦珑， 马学琴， 杨美玲 (宁夏医科大学高职学院， 银川 750004;宁夏医科大学药学院)

金叶接骨木(Sambucus canadensis.Aurea)为忍冬科接骨木属植物加拿大接骨木(Sambucus Canadensis L.)的彩色叶变种，我区作为观赏植物从外地引进并在银川地区栽培［1］。接骨木属植物有着广泛的临床药用价值，其中齐墩果酸、熊果酸是接骨木属植物抗病毒性肝炎活性成分，临床用于治疗急性病毒性肝炎疗效显著［2］。本人在前期的实验中检测出金叶接骨木的茎叶中含有槲皮素、芸香苷以及熊果酸、齐墩果酸等化学成分［3］。金叶接骨木如接骨木属其他植物一样具有一定药用价值，本文对银川地区引种的3年生金叶接骨木茎叶中齐墩果酸和熊果酸2种成分进行含量测定，并建立高效液相色谱法测定金叶接骨木中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，为进一步开发和利用其植物提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日立 L2000高效液相色谱仪(L-2455DAD)检测器，L-2300柱温箱，L-2200自动进样器，L-2130四元泵，分析天平(AP210，1/10万)，超声波提取器(KQ-500B)，中药材粉碎机(FW100型)。

1.2 试药 齐墩果酸对照品(批号110742－200314，中国药品生物制品检定所);熊果酸对照品(批号8502，中国药品生物制品检定所);甲醇(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司);乙腈(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司);娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:美国 Thermo ODS-2HYPERSIL(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－0.4%磷酸水溶液(80%∶20%);检测波长:210 nm，流速0.8 ml/min，柱温:25 ℃。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称量熊果酸对照品5.0 mg、齐墩果酸对照品 1.3 mg，共同置 5 ml容量瓶中，色谱甲醇溶解，定容，得熊果酸、齐墩果酸混合对照品溶液，临用前稀释［4，5］。在 2.1 项所述色谱条件下，取对照品溶液进样10 μl检测，理论塔板数为5 000，齐墩果酸和熊果酸分离度为1.6，得色谱图1。

图1 齐墩果酸、熊果酸对照品HPLC色谱图Fig 1 High performance liquid chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

结果显示，齐墩果酸色谱峰保留时间为28.00 min，熊果酸色谱峰保留时间在29.59 min，两者能够基线分离。

2.3 供试品溶液的制备 分别取金叶接骨木的叶和茎药材，粉碎，过80目筛，60℃干燥至恒重。分别精密称取适量(相当生药0.5 g)，置200 ml具塞三角锥形瓶中，加入甲醇10 ml，超声提取40 min，冷却，过滤，滤液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中得金叶接骨木叶和茎药材供试品溶液。

2.4 线性范围考察 取稀释后的齐墩果酸、熊果酸混合对照品溶液(齐墩果酸、熊果酸浓度分别为243.36 μg/ml，64.92 μg/ml)，分别稀释1.5，2，3，4，10，20倍后按2.1项下色谱条件进样检测，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标进行线性回归。从标准曲线图中测得齐墩果酸回归方程C=0.000 1A+3.440 5，r=0.999 9，表明齐墩果酸在 12.17 －243.36 μg/ml浓度范围内线性关系良好;熊果酸回归方程 C=4 ×10－5A+0.979 1，r=0.999 8，表明熊果酸在3.25 －64.92 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.5 稳定性试验 取同一金叶接骨木叶供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 进样测定，考察其稳定性。记录峰面积，计算齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为0.63%和0.81%。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.6 精密度试验 取同一金叶接骨木叶供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算齐墩果酸和熊果酸峰面积的 RSD，RSD分别为1.05%和0.73%(n=6)。表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 精密称定同一批金叶接骨木叶样品，按2.2项下方法分别制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，分别按回归方程计算齐墩果酸和熊果酸的含量。其RSD值分别为0.85%和1.42%(n=6)，表明此方法重复性良好。

2.8 加样回收率 称取已知含量的金叶接骨木叶样品6份，每份约0.5 g，准确计算样品中齐墩果酸和熊果酸的含量，分别加入适量齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，进样，结果见表1。

表1 齐墩果酸和熊果酸加样回收率的试验结果 (mg，n=6)Tab 1 The recovery results of oleanolic acid and ursolic acid (mg，n=6)

结果显示，齐墩果酸和熊果酸的加样回收率分别为 98.50%(RSD 为 3.03%)和 99.49%(RSD 为1.37%)，回收率良好。

2.9 样品测定 分别取金叶接骨木叶和茎药材粉末约0.5 g精密称定，按照2.3项下方法制备供试液，按2.1项下色谱条件分别取10 μl进样检测，记录金叶接骨木茎和叶的色谱图和峰面积，见图2，3。高效液相色谱法测得金叶接骨木茎和叶样品中齐墩果酸与熊果酸含量，见表2。

3 讨论

图2 金叶接骨木茎供试液色谱图Fig 2 The chromatogram of the test solution from the stem of Sambucus canadensis Aurea

图3 金叶接骨木叶供试液色谱图Fig 3 The chromatogram of the test solution from the leaves of Sambucus canadensis Aurea

表2 金叶接骨木茎和叶中齐墩果酸和熊果酸含量(mg/g)Tab 2 The contents of oleanolic acid and ursolic acid in the stem and the leaves of Sambucus canadensis Aurea(mg/g)

齐墩果酸与熊果酸均属三萜类化合物，结构相似，其理化性质相近，因而在色谱柱上的保留时间非常相近，如果柱效不高并且流动相选择不当时，很难将其分开。本实验采用HPLC法同时测定金叶接骨木茎叶中的这两种成分时，采用调节流动相的pH值，并加大流动相中水的比例，可以有效地将两者分开。在2.1所述色谱条件下，取对照品溶液进样10 μl检测，理论塔板数为5 000，齐墩果酸和熊果酸分离度为1.6。本法定量准确，回收率高，并能同时测出齐墩果酸与熊果酸的含量，简单易行，可做为同时含有齐墩果酸与熊果酸植物的测定标准。

金叶接骨木在我国多省区均有栽培，其枝繁叶茂，资源丰富，能否如接骨木属植物一样具有药用价值，本次实验为进一步开发和利用其植物提供了一定的科学依据。

［1］ 曹兵，宋丽华，马国彬，等.银川地区14种绿化树种的引种试验报告［J］.农业科学研究，2007，28(3):72.

［2］ 陈武，李开泉，熊筱娟，等.陆英抗肝炎活性成分的研究［J］.南昌大学学报:理科版，2001，25(2):165 －167.

［3］ 赵淑红，高亦珑，徐力生，等.银川引种金叶接骨木药用价值初探［J］.宁夏医学杂志，2010，32(1):58 －59.

［4］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版1部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录28－30.

［5］ 邹盛勤，陈武.地榆中乌索酸和齐墩果酸含量的高效液相色谱测定［J］.时珍国医国药，2006，17(8):1373 －1374.