连作烤烟根际土壤自毒物质成分分析

陈冬梅，杨宇虹，晋 艳，王海斌，段玉琪，尤垂淮，田卫霞，林瑞余，林文雄

(1.福建农林大学农业生态研究所，福建 福州 350002；2.云南省烟草农业科学研究院，云南 玉溪 653100)

连作障碍(Successive cropping obstacles)是指在同一块土壤中连续栽培同种或同科的作物时，即使在正常的栽培管理状况下，也会出现长势变弱、产量降低、品质下降、病虫害严重的现象[1]。烟草(Nicotianatabacum)是我国最重要的经济作物之一，也是忌连作的作物，烟草长期连作极易造成病虫害增多，产量、品质下降，连作障碍是烟草生产中亟待解决的问题。

目前，作物连作障碍的成因可归纳为3个方面，即土壤理化性状变劣、化感自毒作用和土壤微生物区系的变化[2-4]。据报道，作物连作障碍与根系分泌物中的化感物质密切相关，例如，黄瓜(Cucumissativus)[5]、辣椒(Capsicumfrutescens)[6]、大豆(Glycinemax)[7]和地黄(Radixrehmanniae)等[8]植物的根系分泌物均具有自毒作用，这些自毒物质可以通过影响细胞膜透性、酶活性、离子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白质和DNA表达等多种途径来影响植物生长。陈冬梅[9]研究发现，自毒物质是导致烟草连作障碍的关键因素之一，深入分析烟草连作土壤化学物质成分，对揭示烟草连作障碍机理具有重要意义。然而土壤是一个复杂的体系，土壤化学成分复杂，土壤中自毒物质成分难以分离与鉴定。因此，本研究以连作烤烟12年的土壤为材料，探讨烤烟连作土壤与对照土壤自毒潜力及其主要化学物质成分差异，为进一步分离、鉴定烟草自毒物质提供依据。

1 材料与方法

1.1试验时间、地点 田间试验于2008-2009年在云南烟草科学研究院玉溪试验基地进行。

1.2试验材料 供试烤烟品种为K326。烟田为连作烤烟12年的田地，以未种植过烟草的田地为对照。连作烟田的基本理化指标为：土壤pH值7.96，有机质含量2.03%，水解氮51.2 mg/kg，速效磷63.3 mg/kg，速效钾164.8 mg/kg，全氮1.12 g/kg，全磷2.16 g/kg，全钾12.8 g/kg，阳离子交换量57.7 mmol/kg；对照土壤的基本理化指标为：土壤pH值7.89，有机质含量1.98%，水解氮49.8 mg/kg，速效磷61.2 mg/kg，速效钾167.3 mg/kg，全氮1.08 g/kg，全磷2.05 g/kg，全钾11.5 g/kg，阳离子交换量56.8 mmol/kg。

采用四分法收集烟草根际土壤和对照土壤，用于土壤自毒潜力分析及化学物质成分检测。

1.3土壤自毒潜力分析 根际土壤化感自毒潜力评价采用土壤-琼脂三明治法[10]进行测定，并略做修改。称取土壤样品15 g，倒入30 mL冷却至约45 ℃，质量分数为0.8%的琼脂溶液，充分混匀，待固化后再加入2 mL质量分数为0.5%的琼脂溶液覆盖表面，冷却后每个培养皿中播入10粒预萌发的莴苣(Lactucasativa)或烟草，设无土处理为对照，5次重复，置于人工气候箱中。莴苣培养温度为25 ℃，烟草培养温度为30 ℃，每天光照12 h(07:00-19:00)。莴苣培养3 d后测定根长，烟草根长在培养10 d后测定。不同土壤的化感自毒潜力，即受体的相对抑制率(Inhibition rate，IR)计算公式为：

IR=(1-处理值/对照值)×100%。

1.4土壤浸提液制备及自毒潜力分析 将土壤风干过2 mm筛，称取1 000 g加入70%的乙醇2 L，超声波浸提1 h，重复浸提3次，过滤并浓缩至200 mL，得到5 g/mL的浸提液(即1 mL水溶液中含5 g土壤提取物)。以5 g/mL的浸提液为母液，配制2 g/mL 浸提液，以相同质量浓度的土壤浸提液为对照。每个培养皿中点播10粒预萌发的莴苣或烟草种子后，分别添加5 mL不同土壤浸提液或无菌水，莴苣培养3 d后测定根长，烟草根长在培养10 d后测定。不同土壤浸提液的化感自毒潜力计算同上。

1.5土壤化学物质成分的GC-MS鉴定 不同土壤乙醇提取液硅烷化后，进行GC-MS分析。GC-MS条件：气相色谱质谱仪为varinaic 240GC-450MS，色谱柱为FactorFourTM:capillary column VF-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm。程序升温(乙醇)：初始温度60 ℃，以15 ℃/min升至140 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升至200 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。总运行时间41.33 min。程序升温(氯仿)：初始温度60 ℃，以10 ℃/min升至140 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。总运行时间40.33 min。进样口温度220 ℃，载气：氦(He)，流量0.8 mL/L；进样量为1 μL。质谱条件：EI电离方式，电子能量70 eV；阱温200 ℃；阱外套温度50 ℃；传输线温度280 ℃；扫描范围50～1 000 amu。用谱图库(NIST98 & WILEY)检索确定各种化合物。

1.6数据分析 采用 DPS统计软件进行有关数据的统计、方差分析及显著性分析。

2 结果与分析

2.1烤烟根际土壤化感自毒潜力分析 土壤自毒潜力分析显示，对照土壤处理下莴苣、烟草的根长分别为2.22和0.59 cm，连作烟草根际土壤处理下则分别为1.03和0.34 cm(表1)，与对照相比，烤烟根际土壤对受体莴苣及烟草的抑制率分别为53.60%和42.37%。可见连作烤烟根际土壤对受体莴苣及烟草具有较强的化感自毒潜力。进一步分析土壤提取液对受体生长的影响，结果表明，与对照相比，烤烟根际土壤对受体莴苣及烟草的抑制率为45.96%和34.92%，说明烤烟根际土壤提取液对莴苣及烟草根长生长依然具有明显的化感抑制作用。

2.2烤烟根际土壤化学物质成分分析

2.2.1糖类物质分析 GC、MS分析结果表明(表2)，对照土壤中存在7种糖类物质，而连作烟草根际土壤中仅存在2种糖类物质。可见烟草连作后，根际土壤糖类物质发生显著变化，种类明显减少。

2.2.2酸类物质分析 分析结果表明(表3)，对照土壤与连作烟草根际土壤中酸类物质成分差异显著。对照土壤中存在14种酸类物质，连作烟草根际土壤中仅有3种酸类物质。可见烟草连作后，烟草根际土壤酸类物质种类显著减少。

2.2.3酯类物质分析 分析结果表明(表4)，对照土壤中存在16种酯类物质，而连作烟草根际土壤中仅存在8种，且连作烟草根际土壤中检测到的酯类物质在对照土壤中均存在。可见烟草连作后，烟草根际土壤中酯类物质种类明显减少了一半。

2.2.4其他物质分析 分析结果表明(表5)，对照土壤中检测到1个醇类物质，连作烟草根际土壤中检测到12个其他物质。可见烟草连作导致根际土壤物质成分发生明显变化。

表2 不同处理条件烤烟根际土壤糖类物质成分

表3 不同处理条件烤烟根际土壤酸类物质成分

表4 不同处理条件烤烟根际土壤酯类物质成分

3 讨论与结论

连作烤烟根系分泌物具有明显的自毒作用，能够显著抑制烟草幼苗对营养成分的吸收与利用[11]。这与本研究发现连作烤烟根际土壤对受体植物莴苣、烟草幼苗具有明显的化感自毒作用相一致。此外，本研究的土壤浸提液生物测试结果表明，连作烤烟根际土壤浸提液也具有明显的化感自毒潜力，这与连作烤烟根际土壤中存在的自毒物质密切相关。本研究通过GC-MS技术分析土壤浸提液化学成分表明，对照土壤中存在7种糖类物质、14种酸类物质、16种酯类物质、1种其他类物质；而连作烤烟根际土壤中存在2种糖类物质、3种酸类物质、8种酯类物质、12种其他类物质。连作烤烟根际土壤中存在的糖类、酸类及酯类物质，在对照土壤中均可找到；连作烤烟根际土壤中则具有特异的12种物质，其中有8种物质与化感自毒作用相关，而对照土壤中仅存在1个醇类物质。香草醛具有较强的化感潜力[12]。洋地黄毒素是一类具有较强毒害作用的毒性物质[13]。水稻(Oryzasativa)根系分泌成分中的雪松醇在较低浓度下即可对受体莴苣具有较强化感潜力[14]。植酮、β-谷甾醇、胆甾烷醇、胆甾烷-3-酮等在一定浓度下也具有较强的化感自毒作用[15-17]。此外，本研究还发现连作烤烟根际土壤中存在特异的化学物质——诱虫烯，它能够引诱植物害虫并对自身生长造成危害[18]。可见烟草长期连作后，根际土壤化学成分发生显著的变化，土壤中存在大量与烟草自身化感自毒作用相关的物质。

表5 不同处理条件烤烟根际土壤其他类物质成分

综上所述，烟草长期连作导致其自毒作用加剧，而这种连作障碍加剧可能与烟草连作过程中分泌的自毒物质及昆虫引诱物有关。土壤是一个复杂的体系，烟草连作过程中自毒物质释放后需进入土壤，而土壤中存在大量的微生物，自毒物质释放后是否需经过微生物的吸收转化，还是直接起作用，土壤中检测到的自毒物质其自毒作用浓度及范围是多少，自毒物质对土壤微生物多样性及土壤酶活性的影响，还有待于进一步深入探讨。

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