蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及标记的开发

屠德鹏，魏臻武，武自念，雷艳芳，张 栋，邱伟伟

(1．扬州大学动物科学与技术学院 扬州大学草业科学研究所，江苏 扬州 225009； 2.上海鼎牛饲料有限公司，上海 200436)

随着分子生物学、基因组学和功能基因组学的快速发展，分子标记技术的应用也越来越广泛[1-3]。苜蓿(Medicagosativa)分子标记辅助育种是加速苜蓿育种进程的重要手段之一。魏臻武[4]利用SSR、ISSR、RAPD标记技术构建了苜蓿的指纹图谱，指纹图谱可以鉴定苜蓿品种、品系和选择杂交亲本，为育种工作提供保障。在众多的分子标记中，SSR(simple sequence repeat)标记以含量丰富、遍布整个基因组、共显性、多态性高等优点被广泛应用[5-7]。传统SSR引物开发一般是通过构建基因组文库、Southern杂交、基因克隆和测序等程序进行的，该方法工作量大、成功率低且成本较高[5]。

蒺藜苜蓿(M.truncatula)作为豆科模式植物，具有遗传转化效率高、生长期短、基因组小、自花授粉、固氮等优点[8-10]。蒺藜苜蓿与苜蓿亲缘关系很近，与苜蓿基因组具有很高的同源性。因而从蒺藜苜蓿获得的信息可以用于苜蓿中，这对于促进豆类作物和苜蓿等牧草的育种有重要意义。随着对蒺藜苜蓿基因组学的深入研究，SSR标记已不能满足蒺藜苜蓿高密度遗传图谱构建、基因克隆等研究的需要。因此，需要开发大量新的标记。

表达序列标签(expressed sequence tags,EST)是指从不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆进行5′或3′端测序后得到的长约300～500 bp的基因表达序列片段[11-12]。EST-SSRs是基于EST的新型分子标记，EST-SSRs与基因组SSR标记相比不但具有可以直接获得基因表达信息，为功能基因提供可靠标记的优点，而且具有通用性高、开发简单且成本较低等优点[13]。在小麦(Triticumaestivum)[14]、大豆(Glycinemax)[15]、苜蓿[4,16]、高羊茅(Festucaarundinacea)[13]、鸭茅(Dactylisglomerata)[17]、鹰嘴豆(Cicerarietinum)[18]、高粱(Sorghumbicolor)[19-20]等植物的EST序列中检测到2%～10%的EST-SSRs。从而可见，EST中含有大量的SSR，为SSR标记的开发提供了一个巨大的DNA序列来源。目前，NCBI上公布的蒺藜苜蓿EST已达285 285条，大量EST的存在为蒺藜苜蓿EST-SSRs标记的开发奠定了基础。

该试验利用NCBI上公布的蒺藜苜蓿EST序列，查找EST-SSRs，分析SSR在蒺藜苜蓿EST中的分布特征。设计EST-SSRs引物，利用蒺藜苜蓿重组自交系 (RIL)群体及其亲本进行电泳检测，开发新的EST-SSRs标记。这些新的EST-SSRs标记，为蒺藜苜蓿高密度遗传图谱的构建、遗传多样性、基因克隆、数量性状基因位点(QTL)定位及引物通用性等方面的研究提供材料来源。

1 材料与方法

1.1材料 试验材料为来自法国的蒺藜苜蓿Jemalong中的A20和A17构建的RIL-8群体及亲本，该群体目前有143个家系。群体和亲本2009年10月种植在扬州大学草业科学实验基地，试验地土壤肥力中等偏上，有机质含量为1.2%，全氮含量0.12%，碱解氮100.4 mg/kg，速效磷88.7 mg/kg，速效钾36.3 mg/kg。条播，行距0.7 m，小区面积为1 m×2 m。全年不施肥。适时排灌水，人工除草。

1.2方法

1.2.1DNA的提取 采用魏臻武[4]稍加改进的CTAB法提取基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶和紫外分光光度计对其质量和浓度进行检测。提取的DNA溶解于100 μL TE后放入4℃冰箱备用。

1.2.2蒺藜苜蓿EST序列中SSR的检索 从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网上下载285 285条蒺藜苜蓿EST序列。利用SSRIT(simple sequence repeat identification tool)软件检索重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的SSR，标准为重复序列长度≥20 bp，即二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复次数分别大于或等于10、7、5、4、4。

1.2.3EST-SSRs引物设计 利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物设定的条件如下：引物长度范围为18～22 bp；引物退火温度在50～60℃，上下引物退火温度相差不超过2℃；GC含量在40%～60%，最佳为50%，且上下引物序列GC含量的差异不能太大，3′端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续的3个G或C；扩增产物在100～600 bp；尽量避免形成稳定的引物二聚体(dimer and cross dimer)和发夹结构(hairpin)。设计的引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.4SSR扩增反应体系 DNA模板(20～90 ng/μL)3 μL；引物(10 pmol/μL)3 μL；反应体系混合物配比:0.24 μL dNTP (10 mmol/L) +1.5μL 10×Buffer + 0.9 μL Mg2+(20 mmol/L) + 0.16 μL TaqDNA聚合酶(1U) +1.2 μL ddH2O[11]。反应体系为10 μL(每孔添加量)。

扩增反应程序：94℃预变性3 min，95℃变性1 min，52℃退火1.5 min(不同引物退火温度不同)，72℃延伸1 min，共循环35次，最后72℃保温8 min，4℃保存。

1.2.5凝胶电泳及银染 PCR扩增产物中加入1 μL Loading buffer(溴酚蓝缓冲液)，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，150 V恒电压，然后银染检测，拍照保存。

2 结果与分析

2.1蒺藜苜蓿EST-SSRs的检索 从285 285条EST序列中共检测SSR序列6 688条，分布于6 512个EST序列中。EST-SSRs占所有EST总数的2.28%，其中二、三、四、五和六核苷酸重复基元分别占总SSR的34.4%、29.6%、10.2%、11.8%和14.0%，二核苷酸和三核苷酸出现频率最高，四核苷酸重复基元出现的频率最低，为10.2%(表1)。

表1 EST-SSRs序列中不同重复核苷酸数的数量及百分比

2.2蒺藜苜蓿EST-SSRs的分布特征 在检测到的2 301条含有二核苷酸重复基元的EST-SSRs中，含GA/TC和AG/CT重复基元最多，分别占SSRs总数的17.49%(1 170条)和11.21%(55条)(图1)；其中CG/CG重复基元没有出现。三核苷酸重复基元中以GAA/TTC出现的频率最高，为7.10%；其次是AAG/CTT、AGA/TCT、ATG/CAT和AAT/ATT，占总SSRs比例分别为4.28%、3.75%、1.67%和1.50%，其他重复基元出现的频率较低。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸出现频率较高的为AATT/AATT(1.58%)、CTCA/TGAG(1.48%)、AAATC/GATTT(0.57%)和TCTAAA/TTTAGA(1.06%)。其余各重复基元频率都较低。

对于重复次数，二核苷酸基元的重复次数类型多、跨度大。其中GA/TC基元跨度最大，达72种，重复次数为10～87次；其次为AG/CT基元，跨度为47种，重复次数为10～79次；AT/AT和TA/TA基元跨度也较大，重复次数分别为10～34和10～37。三核苷酸基元重复次数类型和跨度比二核苷酸小，其中GAA/TTC(11种)、AGA/TCT(8种)、 AAG/CTT(7种)和ACT/AGT(6种)，其他重复基元的重复次数多以7、8、9次出现。四核苷酸中ATAG/CTAT(4种)和CTCA/TGAG(4种)跨度较大，其他类型重复次数多以4、5次出现。五核苷酸和六核苷酸重复基元的重复次数多以4、5、6次中的一种或两种出现(表2)。

图1 蒺藜苜蓿EST-SSRs主要重复基元分布图

表2 蒺藜苜蓿EST-SSRs各基元类型的重复次数分布

2.3蒺藜苜蓿EST-SSRs电泳筛选结果 利用Primer Premier 5.0软件对6 688条EST-SSRs进行引物设计，去除重复等不合适的引物共设计出3 090对，随机选取100对引物合成，以RIL-8群体亲本A17和A20的DNA为模板进行扩增、筛选，筛选出多态性的引物在RIL-8群体中扩增、电泳(图2)。在A17和A20上有清晰条带为85对，占所设计引物比例的85%。其中有多态性的引物29对(表3)，占34.1%(图3)。多态性引物均能在RIL-8群体中扩增出稳定的产物。

图2 MES028在部分蒺藜苜蓿RIL-8群体上的电泳图

表3 29对蒺藜苜蓿EST-SSRs多态性引物

图3 MES001～MES024在蒺藜苜蓿A17和A20上的电泳图

3 讨论

3.1EST-SSRs的分布特征 在小麦[14]、大豆[15]、莴苣(Lactucasativa)[21]等大多数植物的EST-SSRs中发现，三核苷酸重复出现的频率比二核苷酸重复高。而在本研究中EST-SSRs的分布二核苷酸基元(34.4%)略大于三核苷酸基元(29.6%)。在鹅掌楸(Liriodendronchinense)[22]、芝麻(Sesamumindicum)[23]、砂梨(Pyruspyrifolia)[24]等中也得到了同样的结论。这可能是与本研究中检索SSR的标准为重复序列≥20 bp有关。Thiel等[25]的研究结果中显示18 bp长度时，三核苷酸重复基元出现的频率高于二核苷酸重复基元。大多数作物中二核苷酸重复基元以GA/TC出现的频率最高，而CG/CG重复基元出现的频率最低，如水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大豆、高粱等[26-27]。本试验中GA/TC出现的频率是最高的，而CG/CG没有出现，该结论与大多数植物的研究结果一致。不同植物三核苷酸重复基元主要的重复类型变化较大，小麦以AAC/GTT出现的频率最高[14]，大麦(Hordeumvulgare)、玉米、水稻和高粱中则出现的频率最高是GGC/GCC[28]；鹅掌楸中是以AAG/CTT重复基元出现频率较高，占三核苷酸重复基元的40.2%[22](表4)；本研究检测到的1 982条三核苷酸重复基元中GAA/TTC出现的频率最高，为475条，占总检测SSR的7.1%，占三核苷酸重复基元的24%，本研究结论与在大豆上的检测结果是一致的[15]。

3.2EST-SSRs标记的开发 随着分子标记和测序技术的快速发展，EST-SSRs的应用也越来越普遍，为EST-SSRs标记的开发提供了广阔的前景。截至到2010年6月11日，从NCBI中的dbEST数据库中蒺藜苜蓿的EST序列已达到285 285条，与2002年12月31日的147 000条EST相比，增加了将近一倍。目前，在多种作物中EST-SSRs都展开了研究，陈海梅等[14]在小麦的EST中检测到1.34%的序列中含SSR，并将43个EST-SSRs位点绘制到小麦的遗传图谱上；常玮等[15]在大豆的458 220条EST中获得无冗余的SSR序列8 190条，设计的200对引物中148对有清晰且单一条带扩增产物，开发了148个新的SSR标记。在牧草中EST-SSRs的研究也比较普遍，Eujayl等[6]研究蒺藜苜蓿EST-SSRs在苜蓿属中的通用性，结果表明74%的EST-SSRs引物在苜蓿属中有扩增产物；Sim等[29]研究了谷物的EST-SSRs在黑麦草(Loliumspp.)中的通用性，来自谷物的165个EST-SSRs中，57%的EST-SSRs在黑麦草中有扩增产物，且多态率达67%； Xie等[17]利用50对谷物(玉米、小麦和高粱)的EST-SSRs和15对鸭茅SSR引物对74个鸭茅材料进行护增，其多态率为84.63%；Simko[21]从莴苣的19 523条EST中检测到4.5%的EST含有SSR序列(重复序列≥20 bp)。本研究在285 285条EST中检测到6 512条EST含有SSR序列，SSR序列为6 688条。随机设计的100对引物中，在蒺藜苜蓿RIL-8群体亲本A17和A20中85对引物有扩增产物，开发了85个新的SSR标记。具有多态性的引物为29对。

表4 部分植物出现频率最高的核苷酸重复基元

4 结论

1)从NCBI数据库285 285条EST序列中检测到6 688条SSR序列。占 EST总数的2.28%，二核苷酸出现频率最高，其次为三核苷酸，二、三核苷酸占所有核苷酸的64%。四核苷酸分布最少，为10.2%。

2)蒺藜苜蓿基因组中GA/TC和AG/TC重复基元占SSRs总数的17.49%和11.21%，在各种重复基元中最多。蒺藜苜蓿基因组中CG/CG重复基元没有出现。

3)利用EST-SSRs序列随机设计100对引物，在蒺藜苜蓿RIL-8群体亲本A17和A20中扩增、电泳，85对引物具有清晰的扩增条带，开发了85个新的SSR标记。具有多态性的引物为29对。这些EST-SSRs标记可以为蒺藜苜蓿高密度遗传图谱的构建、遗传多样性、基因克隆、QTL定位及引物通用性等方面的研究提供材料来源。

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