仙鹤草水提物急性毒性和遗传毒性实验研究

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(1.海门市悦来医院,江苏 海门 226131；2.南通大学，江苏 南通 226007)

仙鹤草为蔷薇科多年生草本植物龙牙草(AgrimoniapilosaLedeb)的全草,又名脱力草、龙牙草、黄龙尾、狼牙草等，在我国大部分地区均有分布，全草含仙鹤草素、仙鹤草、内酯、鞣质、有机酸、酚性成分、皂甙等化学成分。现代药理研究[1]表明仙鹤草及其提取物具有抗肿瘤、抗炎镇痛、降血糖、降血压、增强机体免疫功能等作用，临床上主要用于止血、抗肿瘤，泌尿、呼吸、消化系统等疾病及妇科病的治疗。但有关仙鹤草急性毒性和遗传毒性的报道甚少。根据有关规定本研究对仙鹤草水提物进行了急性毒性和微核实验评价研究[2]。采用不同的实验指标,了解仙鹤草水提物的急性毒性及可能的中毒症状，测定其最大耐受量，为其在临床上的安全应用提供可靠的科学依据及安全性评价。

1 实验材料

1.1 药品 仙鹤草水提物：称取干燥仙鹤草(购于中药店)100 g,加入10倍体积的水，加热提取2次,每次2 h，合并提取液，浓缩为80 mL，生药含量1.25 g/mL。高速冷冻离心，用直径为0.22 μm的微孔滤膜正压过滤除菌。制备成1～2 g/mL水提液(水煮醇沉、过滤浓缩)备用。灌胃体积为0.4 mL/20 g。

1.2 实验动物 健康成年ICR小鼠,由南通大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(苏)2006-0019。体质量18～22 g，雌雄各半，禁食10 h后进行实验。实验温度(24±1)℃，相对湿度60%。实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体质量及精神状况。

1.3 实验试剂 1)注射用环磷酰胺(CY)：批号，900421，上海第十二制药厂生产。2)小牛血清：滤菌后放入56 ℃恒温水浴保温1 h进行灭活，4 ℃储存。亦可用大、小鼠血清代替。3)Giemsa原液：称取Giemsa染料3.8 g，加入375 mL甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后，加甘油125 mL，37 ℃恒温箱保温48 h，振摇数次，过滤，2周后可使用。4)磷酸盐缓冲液(pH 6.8)：KH2PO44.50 g，Na2HPO4·12H2O 11.81 g，蒸馏水至1 000 mL。

2 方法与结果

2.1 急性毒性实验[3]预试验：小鼠30只，随机分为3组，每组10只，以不同剂量的仙鹤草水提物灌胃，其中组1用量为20 g/kg；组2用量40 g/kg；组3用量80 g/kg。灌胃前动物禁食过夜，自由饮水。灌胃后给予正常饮食，观察中毒症状、死亡情况，观察24 h,未见小鼠出现任何中毒反应(观察记录的内容包括皮肤、黏膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现等)。

最大耐受量测定：小鼠30只，以80 g/kg仙鹤草水提物灌胃，连续观察7 d，未发现小鼠有任何中毒症状，在观察期内所有小鼠均存活。

结论：小鼠灌胃给予仙鹤草水提物浸膏的最大耐受量>80 g/kg。2周内无动物死亡，亦无明显的中毒表现或不良反应。即仙鹤草对雄、雌性ICR种小鼠的急性毒性LD50均>80 g/kg，属无毒物。

2.2 微核试验[4]取体质量18～20 g ICR小鼠50只，分为5个试验组,每组10只，雌雄各半。试验组分别为空白组生理盐水，阳性对照组环磷酰胺，仙鹤草高剂量组80 g/kg,仙鹤草中剂量组40 g/kg，仙鹤草低剂量组20 g/kg。阳性对照组用环磷酰胺生理盐水溶液1次腹腔注射50 mg/kg。2次接毒，间隔24 h。

制片：在第2次给予受试物6 h时将小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉碎片，剪去两端骨骺(小鼠股骨较短、细，剪股骨头时,应尽量保持股骨中段的完整)后，用配有6号针头的l mL注射器吸取小牛血清约0.05 mL，从股骨上端开口处冲洗骨髓腔数次，将冲洗物从股骨下端开口处滴到载玻片上。

推片：以同一注射器吸取载玻片上的冲洗物，然后推出，如此重复数次，使之调匀后，推片若干张迅速干燥。

固定：将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10 min，取出晾干。

染色：固定好的涂片用Gimsa染色l5～30 min。用纯化水冲洗,干燥，待检。染液浓度、pH、染色时间等多种因素可影响染色效果，例如微核可被染成鲜红色、蓝紫色或紫红色，甚至同一张标本上也会出现染色深浅不一致的现象,因此计数前时必须仔细观察PCE和成熟红细胞的差别,正确辨认。每只小白鼠计数1 000个嗜多染红细胞中具有微核的细胞数，微核率用‰表示。

先在低倍镜下选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区域，再转到油镜下，观察嗜多染红细胞的微核。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，偶尔呈肾形、马蹄形或环形,嗜色性与主核一致，直径通常为红细胞的1/20～1/5。每张玻片标本计数100～200个嗜多染红细胞，按“‰”计算微核的出现率，微核计数以“细胞”为单位，即1个细胞中出现2个或2个以上微核时，只按“1”计算。

结果：各剂量组不同性别动物骨髓嗜多染红细胞微核细胞率与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。阳性对照组与阴性对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.01),表明受试物在最高剂量80 g/kg下，未见有诱发小鼠骨髓微核细胞率增高作用，见表1。

表1 仙鹤草对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

3 讨论

仙鹤草首载于《本草图经》，主要功能在于收敛止血。近人李钟文氏则认为仙鹤草很多重要功能都已失传，经其从本草古图谱、药用部位、植物形态等多方面考证，认为现在“处处有之”的仙鹤草，就是古人治疗险恶之症的牙子。其名称演变过程为牙子一狼牙一狼牙草一龙牙草一龙芽草一仙鹤草[5]。在《神农本草经》中仙鹤草被归于“多毒不可久服的下品药，载：“牙子味苦寒，主邪气热气，疥瘙恶疡疮痔，去白虫。”《名医别录》称其有毒。李时珍亦从“有毒”之说，将其置于毒草类[6]。而现代药理研究[7]也证明，仙鹤草的有效成分鹤草酚有毒，毒性主要表现在胃肠道及神经系统反应，应用较大剂量可使家犬双目失明，病理观察也证明了上述损害。文献报道[8]过量服用仙鹤草致肾功能衰竭。此外临床上仙鹤草不良反应主要有失明、呼吸困难、皮疹、头昏、面红、恶心呕吐、甚至引起过敏性休克。在大剂量应用仙鹤草时应权衡利弊,每剂高达500 g的剂量应尽量避免。

仙鹤草是否无毒以及能否毫无顾忌地大剂量使用，事关临床用药的安全性。近年来，许多中药毒理学研究表明，某些中草药及其所含的某些化学成分具有特殊毒副作用，故对中草药的毒理研究应予高度重视。特别在遗传毒性研究中，微核试验是目前国内外广泛用于检测染色体损伤的一种快速、经济、简便的致突变筛选试验[9]。本文的目的就在于阐明仙鹤草水提物安全性，对仙鹤草进行实验的结果显示：仙鹤草无明显急性毒性反应，无遗传毒性，是一种安全无毒的中药，可开发成中药新药，挖掘其临床应用价值，为广大患者造福。

[1]金在久.仙鹤草的化学成分及临床研究进展[J].华西药学杂志,2006,21(5):468-471.

[2]中华人民共和国卫生部药政局.新药(西药)临床研究指导原则汇编(药学·药理学·毒理学)[M].北京:科学技术出版社,1993:203-204.

[3]李仪奎,王钦茂,陈奇,等.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:299-305.

[4]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,1985:508.

[5]宋·唐慎微.重修政和经史证类备用本草[M].北京:人民卫生出版社,1957:258.

[6]明·李时珍.本草纲目(校点本)[M]北京:人民卫生出版社,1982:11.

[7]范尚坦,李金兰,左晖.仙鹤草的不良反应[J].福建中医药,2002,33(1):47-48.

[8]赖中福,卢壬丹.过量服用木通、仙鹤草致肾功能衰竭各1例[J].中国药业,2003,12(7):59.

[9]中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005:88.