玉米生态核雄性不育系的发现与遗传研究

宋鹏举，季洪强，裴东明，胡彦民

(河南农业大学农学院，河南郑州450002)

生态核雄性不育材料的育性转换主要受光照时间、温度等自然条件的影响，在特定的生态条件下既可作为不育系进行制种，又可进行自交系的繁殖，实现一系两用，简化制种程序.由于玉米可以利用人工去雄的方法进行杂交种子的生产，在“两系”法制种应用与研究方面相对落后于水稻、小麦等自花授粉作物，目前只有2种温敏核雄性不育系的研究报道［1，2］，而温敏核雄性不育在应用过程中往往会发生育性波动，截至目前尚没有玉米“两系”法制种的应用报道.因此发掘育性稳定的光敏核雄性不育材料或育性转换温度低的温敏核雄性不育材料已经成为玉米“两系”法制种技术能否实现的关键.汤继华等在2005年育种过程中发现一种新的生态型核不育系春杂，该材料冬季在海南种植雄穗完全可育，而在郑州夏播完全不育.本研究对其生态学机制和遗传机理进行了分析，以其为该材料进一步研究和应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用的春杂是2005年河南农业大学汤继华等从东北引进的一个玉米自交系中发现的.该材料2005年冬在海南表现育性正常，但2006年在郑州夏播条件下却表现为完全不育，初步研究发现该材料是一个生态核雄性不育材料.

1.2 试验材料的田间鉴定

1.2.1 遗传分离群体的田间育性鉴定 2006年发现春杂在郑州夏播条件下表现为完全不育后，用常规自交系87-1的花粉授粉，得到F1群体.2006年冬在海南利用春杂和F1群体构建了F2和BC1分离群体.2007-04-25 将春杂，87-1，F1，F2和BC1群体分别播种在河南农业大学科教园区(郑州)，抽雄期后在田间育性调查，并用χ2检验进行统计分析.

1.2.2 生态学试验的田间鉴定 2009-04-01在河南农业大学科教园区将春杂进行分期播种，每隔10 d播种1期，共8期.从2叶1心开始，每隔2 d调查1次叶龄，至抽雄结束.抽雄后记录单株育性，把花药外露分6级，花药开裂程度分3级，将4/Ⅲ，5/Ⅲ定位为可育株，0/Ⅰ，1/Ⅰ为不育株，2/Ⅱ，3/Ⅱ为部分不育株［3］.散粉期每株取雄穗中部4～6个花药的花粉粒进行混合，用卡诺氏固定液固定24 h，转移到体积分数75%的酒精中保存，IKI溶液染色，镜检观察花粉的染色情况，将花粉粒划分为典败、圆败、染败和正常 4 类型［4，5］.

2010-05-05再次分期播种，每隔10 d播种1期，至2010-07-14播最后1期，共播8期.

1.3 不育基因的定位

2008年在郑州夏播条件下，利用春杂和B 73构建F1群体，2008年冬在海南利用B 73和F1群体构建了BC1群体，2009-06-10将1 500株BC1群体播种在河南农业大学科教园区，利用该分离群体对目标基因进行定位.

利用来自于玉米基因数据库中的500多对SSR引物，结合BSA分群法筛选与生态核雄性不育基因连锁的分子标记，利用与目标基因连锁的SSR标记对春杂和B 73的BC1分离群体进行分析，利用Mapmaker 3.0计算目标基因与连锁标记之间的遗传距离［6～8］.

2 结果与分析

2.1 玉米生态型核不育材料春杂在不同生育时期的育性表现

2009—2010年郑州田间分期播种育性调查结果表明(表1)，在不同播期，生态核雄性不育材料春杂多数表现为颖壳不开裂，花药不能外露，花粉不能正常散出;仅在2009-05-21，05-31，06-11和06-21播种的春杂材料中出现了部分不育单株，而镜检均无正常花粉粒，说明尽管出现了部分开裂现象，仍然表现不育(表2).2 a的分期结果均表明，生态核雄性不育材料春杂在郑州不同播期条件下育性稳定，均表现为雄性不育.

表1 生态核雄性不育材料春杂的田间育性表现Table1 The fertility performance of ecological male sterile line Chunza at different sowing stages

将2009年和2010年春杂分期播种试验中每株玉米取花粉进行镜检，发现3种败育类型都存在(表2).

2 a间的花粉镜检结果表明，相近播期内各种败育类型比例相近，且06-23之前播种的以染败为主，06-23之后播种的以典败为主，说明在郑州地区，随着播期的后推，春杂的花粉败育趋于彻底.而该材料在2005—2008年冬在海南播种均表现为育性正常，说明该材料是一个育性稳定的生态核雄性不育材料.

表2 不同播期对生态核雄性不育系春杂花粉粒育性的影响Table2 The fertility performance of the pollen for the ecological genic male sterile line Chunza

2.2 春杂的遗传机制

对2007年在郑州播种的春杂和87-1及其F1，F2和BC1分离群体的育性田间调查结果进行分析得出，在F2群体中有152株表现为完全可育，58株表现为完全不育，χ2检验符合3∶1的理论比例(表3).同时BC1分离群体的田间育性表现符合1∶1的理论比例，说明该生态核雄性不育系由1对隐性基因控制.F2和BC1分离群体的部分不育株率为9.5%和6.7%，可能是由环境条件引起的非正常单株.

表3 (春杂×87－1)的F2和BC1群体育性分离结果Table3 Fertility segregation of the F2 and BC1 population derived from Chunza and 87－1

2.3 春杂生态核雄性不育基因的定位

在(春杂和B 73)的BC1分离群体中，分别随机选择10株完全可育单株和10株不育单株的DNA进行等量混合，利用混合分群法(BSA)筛选与目标基因连锁的分子标记.在500多对SSR引物中，发现位于第2染色体上2.07区的SSR引物bnlg 1138，bnlg 1329，umc 196，umc 2402，umc 2220，umc 2129在两亲本、可育池和不育池间存在多态性.分别用上述6个引物对1 013株(春杂×B 73)BC1群体进行PCR扩增，经过聚丙烯凝胶电泳分析，分别统计每一分离单株的标记类型.将该生态核雄性不育基因命名为egms 1，利用mapmaker 3.0软件进行连锁分析，发现ms 1与umc 2129和bnlg 1329紧密连锁，其遗传距离分别为6.7和6.2 cm(图1).

图1 生态核雄性不育基因egms 1的遗传图谱Fig.1 The linkage map of the ecological-sensitive genic sterile gene ms 1

3 结语与讨论

分期播种和遗传分析结果表明，春杂在郑州不同播期条件下的育性稳定，均表现为典型的花粉败育，是一种稳定的生态核雄性不育材料，其育性由1对隐性基因控制，该基因位于玉米的第2染色体上.

截至目前，只有2种玉米生态型核雄性不育材料的报道，且均为温敏核雄性不育系，其中琼6Qms是最早报道的是温敏核雄性不育系［9］，但琼6Qms的育性由2对重叠基因控制，受温度和日照长度的共同影响，由于在不育阶段内仍然存在一定数量的可育花粉，在生产上利用存在一定的潜在风险［1］.TANG等［10］报道了1种新型的花药败育型温敏核雄性不育系琼68 ms，其由1对隐性基因控制.但是由于自然条件下温度在不同年份间往往存在较大的差异，因此温敏核雄性不育的利用在生产上存在一定的潜在风险.

河南农业大学发现的生态核雄性不育材料春杂，在郑州不同播期内进行播种均表现出典型的不育特征，而该材料在海南三亚播种4 a均表现出完全可育的特征，因此推测该材料可能是一个育性温度变异范围低的温敏核雄性不育系或者是一个光敏核雄性不育系，在生产上可能具有潜在的利用价值.但是，该材料生态核不育类型的确定还需要经过多年多环境的鉴定.

［1］ 汤继华，胡彦民，付志远，等.一种新型玉米温敏核雄性不育系的发现、鉴定及遗传分析［J］.中国农业科学，2007，40(5):889-894.

［2］ 付志远，赵广远，汤继华，等.两种玉米温敏不育系的育性相关性状的比较及不育基因的初步定位［J］.分子植物育种，2004，2(5):633-636.

［3］ 李竞雄，戴景瑞，许启凤，等.玉米雄花不孕性及其恢复性的遗传研究［J］.作物学报，1963，24(1):339-362.

［4］ DUVICK D N，SNYDER R J，ANDERSON E C.The chromosomal location of Rf 1，a restorer gene for cytoplasmic pollen sterile maize［J］.Genetics，1961，46(10):1245-1252.

［5］ 汤继华，赫忠友，谭树义，等.玉米温敏核雄性不育系的育性转换机制研究［J］.河南农业大学学报，2000，34(1):4-6.

［6］ PENG H F，QIUZ G，CHEN X H，et al.Pollen fertility and cytological observation of a thermo-sensitive genic male sterile line of non-pollen type XianSin rice(Oryza sativa L.)［J］.Acta Ecologica Sinica，2006，26(7):2322-2327.

［7］ JIA J H，ZHANG D S，LI C Y，et al.Molecular mapping of the reverse thermo-sensitive genic male-sterile gene(rtms1)in rice［J］.Theor Appl Genet，2001，103(4):607-612.

［8］ PENG H F，ZHANG Z F，WU B，et al.Genetic characterization and fine mapping of a novel thermo-sensitive genic male-sterile gene tms 6 in rice［J］.Theor Appl Genet，2005，111(7):1271-1277.

［9］ 赫忠友，李元秉，谭树义.温敏核雄性不育玉米的发现及初步研究［J］.作物杂志，1995(2):1-2.

［10］TANG JH，FU Z Y，HU Y M，et al.Genetic analyses and mapping of a new thermo-sensitive genic male sterile gene in maize［J］.Theoretical and Applied Genetics，2006，113(1):11-15.