反复惊厥阈下痫样放电致大鼠持续性情绪唤醒障碍☆

向阳王庆松郑宇

·论 著·

反复惊厥阈下痫样放电致大鼠持续性情绪唤醒障碍☆

向阳*王庆松*郑宇△

目的 探讨反复惊厥阈下痫样放电是否可引发实验大鼠较长时间的情绪唤醒障碍。方法 选择6～7周龄雄性SD大鼠62只，成组设计，随机分为惊厥阈下痫样放电组 （subclinical epileptifor mdis charges group，SED组，n＝16）、海马快速电点燃组（hippocampal kindling group，HK组，n＝16）、海马电极埋植对照组（control of electrode group，EC组，n＝15）、正常对照组（normal control group，NC组，n＝15），建立大鼠反复SED动物模型，通过运动活性、探究行为、拒俘反应性、高架十字迷宫实验，观测电刺激停止后1、7和30 d时实验大鼠情绪唤醒水平改变。结果 与EC组相比，电刺激后7 d，HK组、SED组大鼠旷场爬越行为明显减少 （P＜0.01），后肢性站立、进入高架十字迷宫开臂次数百分比和滞留时间百分比降低（P＜0.05），电刺激后30 d上述差异仍存在（P＜0.05），同时，HK组、SED组大鼠拒俘反应性在电刺激后30 d有明显增加（P＜0.01）。结论 反复惊厥阈下痫样放电引起了实验大鼠持续性运动活性减少、探究行为受抑、警觉水平过高、焦虑不安状态、环境适应能力下降、惊恐逃避反应等多种情绪唤醒障碍。

反复惊厥阈下痫样放电 癫痫 持续性情绪唤醒障碍

癫痫所致认知功能受损与情感行为障碍成为严重影响患者临床诊治和预后的重要因素之一。近年来，随着对没有明显痫性发作的脑电图痫样放电现象，即临床下痫样放电（subclinical epileptiform discharges，SEDs）或发作间痫样放电（interictal epileptiform discharges），对认知功能影响的临床研究，加深了我们对癫痫性精神障碍的认识［1－2］。我们在前期工作中对短期内惊厥阈下痫样放电引起的情感行为障碍进行了初步研究［3－4］，但由于缺乏理想的动物实验模型，长时间反复惊厥阈下痫样放电是否可引发更为持久的认知及情感行为障碍目前仍不明确。为此，本研究在前期工作的基础上，建立起既可较长时间诱发痫样脑电发放、又无明显惊厥行为的大鼠惊厥阈下痫样放电（subconvulsive epileptiform discharges，SED）动物模型，并重点观察了反复惊厥阈下痫样放电（rSED）对实验动物情感行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 6～7周龄健康雄性SD大鼠62只（第三军医大学实验动物中心提供），实验起始体质量180～230 g，12 h光亮／黑暗条件、22～25℃环境温度，分隔喂养。将大鼠随机分为4组，惊厥阈下痫样放电组（SED组，n＝16）、海马快速电点燃组（hippocampal kindling group，HK组，n＝16）、海马电极埋植对照组 （electrode control group，EC组，n＝15）及正常对照组（normal control group，NC组，n＝15）。SED、HK、EC组大鼠分别适应1周后开始做手术植入电极。造模过程中出现死亡或不符合模型要求者，予以剔除并随机补充，保证每组动物数量。

1.2 模型制备

1.2.1 电极包埋与固定 参考文献［4］的办法制备海马电刺激模型：大鼠经3%戊巴比妥钠溶液（30 mg／kg）腹腔注射麻醉后，固定在立体定位仪（NARISHIGE，Japan）上，沿中线切开头皮并将肌肉等组织向两侧剥离后暴露出颅骨，清理干净颅骨表面，待干燥后确定电极植入点。按大鼠脑图谱［5］确定海马CA1区电极埋植部位：记录电极（单股镍铬合金电极，直径0.2 mm）：前囟前2.5 mm、旁开2.0 mm，及前囟后5.0 mm、旁开3.5 mm处钻穿颅骨，插入5.0 mm电极作为记录用引导电极。刺激电极（双股直径0.2 mm镍铬合金漆包线旋扭一起而成，尖距0.1 mm，实验前用万用电表和生理盐水检查电极的绝缘性）：前囟后4.2 mm，中线旁2.0 mm，深2.0 mm。用小型牙钻（307-2型，上海医疗器械厂）钻透颅骨，埋藏电极。各电极用牙托粉固定。术后观察1 h，动物活动正常后即放回原饲养笼内，允许术后恢复1周。实验过程中，HK、SED组分别各有1只动物因电极脱落而被剔除试验。

1.2.2 电刺激参数 采用SEN-3201电子刺激器（NIHON KOHDEN，Japan）进行电刺激。海马快速电点燃按Bengzon等［6］的方法稍加改进：波宽1 ms、频率16 Hz、串长10 s、刺激强度0.5 mA、串隔5 min，恒流、单向方波，平均刺激40次。海马阈下刺激组采用我们前期实验［7］的刺激参数：频率30 Hz、波宽1 ms、串长10 s、刺激强度0.1 mA，每天刺激10次，串隔5 min，连续刺激4 d，恒流、单向方波。

1.2.3 皮层脑电图（electrocorticogram，ECoG）记录采用6200四导生理记录仪（成都仪器厂）记录。实验前记录1 min，实验后先连续记录15 min，然后每隔5 min记录1 min，共记录60 min。以后每次实验前均记录5 min，ECoG确认存在痫样放电后再进行实验，直至实验终点。

1.2.4 癫痫发作分级参照Racine的标准［8］0级：脑电图记录有发作波形，而没有抽搐动作；Ⅰ级：面肌抽动，咀嚼；Ⅱ级：节律性点头；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：站立并双前肢阵挛；Ⅴ级：持续站立和跌倒。

1.3 情感行为与空间学习记忆能力观察

1.3.1 情感行为观察 于电刺激后1、7和30 d时分别取每组大鼠各5只，观察其情感行为改变：①大鼠运动活性：将大鼠轻轻放入旷场行为观察箱（按文献［9－10］自制，60 cm×60 cm×60 cm的无顶木盒，箱底用墨线分为36个等份小方格）中央小方格内，观测5 min内动物的活动情况。计分标准：大鼠1／2以上身体从所在方格进入相邻方格，即爬越1次计1分，所得总分用于评价其运动活性改变［9］；②探究行为：方法同上，观察5 min内大鼠后肢性站立计分改变。计分标准：后肢性站立1次计1分，总分用于评价其探究行为改变［9］；③拒俘反应性：以动物从未接触过的手套轻抓大鼠，观察其反应。记分标准：0：很容易抓取动物；1：尖叫或回避；2：尖叫并回避；3：逃脱；4：逃脱并尖叫；5：咬或试图撕咬手套；6：主动跃起攻击，以此评价动物恐惧与冲突素质特征改变［10］；④高架十字迷宫（按文献［11］制备，木质结构，包括 2个 50 cm×10 cm的相对开臂和2个50 cm×10 cm×40 cm的相对闭臂，闭臂的上部敞开，迷宫中央有10 cm×10 cm的开阔部，迷宫离地面50 cm）实验：将大鼠置于迷宫中央，头朝闭臂。分别记录5 min内大鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间 （以四肢全部入臂或出臂为准），计算大鼠进入开臂的次数和在开臂滞留时间分别占总次数 （进入开臂与闭臂次数之和）及总时间（在开臂与闭臂滞留时间之和）的百分比，以此为评价焦虑指标［11］。

1.3.2 主要观察指标 大鼠爬越行为、后肢性站立、拒俘反应性、高架十字迷宫开臂次数与开臂时间。

1.4 统计学方法 采用Matlab6.5对数据进行统计学分析。计量资料均以（±s）表示。各组比较采用单因素方差分析进行，同一时间各组间方差齐性采用Bartlett检验，同一时间点不同组间两两比较用SNK法（用于方差齐性的大鼠爬越行为、拒俘反应及开臂次数百分比的比较）和Tamhane’s T2法（用于方差不齐性的大鼠后肢性站立、开臂时间百分比的比较）进行分析。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 皮层脑电图变化 正常大鼠海马脑电以5～10 Hz的α波为主要表现，无明显阵发性节律出现，波幅＜100 mV（图1）。海马电极埋植后动物脑电活动无明显变化（图2）。HK组大鼠在痫性发作时出现明显的阵发性长时程高波幅多棘波或多棘慢波（图3）。SED组大鼠在刺激后即可记录到较多的单发或连续的高波幅尖波、棘波、棘慢波。随着时间推移，痫样放电逐渐减少，1月后仍可记录到反复出现的发作性棘、尖、慢波活动（图4）。

2.2 惊厥行为观察 NC组和EC组大鼠无惊厥样表现。HK组大鼠在电刺激5～16次后出现活动逐渐减少，伴有“湿犬样”抖动及挠头动作，再经历4～9次电刺激后开始出现下颌快速咬动或颜面肌抽搐，随后很快出现发作性四肢及全身强直，四肢直立，最后跌倒。刺激停止1 h后发作基本停止。整个发作以强直、阵挛表现为主。根据Racine的标准［8］，HK组大鼠的发作表现均已达到Ⅲ～Ⅴ级。SED组大鼠在电刺激过程中可观察到先出现活动减少，之后逐渐表现出一定的兴奋性，修饰行为或“洗脸”行为增多，但未观察到Ⅰ级以上（含Ⅰ级）惊厥发作。

2.3 大鼠电刺激后不同时间情感行为观察结果

图1 NC组大鼠ECoG记录

图2 EC组大鼠ECoG记录

图3 HK组大鼠ECoG记录（电刺激后惊厥发作时）

图4 SED组大鼠ECoG记录（电刺激后30 d）

表1 四组大鼠的爬越行为计分改变

表2 四组大鼠矿场实验中的站立次数

表3 四组大鼠进入开臂的次数／总次数

2.3.1 大鼠电刺激后不同时间旷场行为改变和高架十字迷宫行为改变结果 表1显示，SED组、HK组大鼠电刺激后1 d内旷场爬越行为明显减少，显示其运动活性降低，至30 d时上述差异仍非常明显；表2显示，电刺激后1 d及7 d时HK组、SED组大鼠后肢性站立显著减少，表明其探究行为明显降低，至30 d时虽有所恢复，但仍存在统计学差异；表3、表4显示，电刺激后1 d及7 d，HK组、SED组大鼠进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比均降低，电刺激后30 d，上述两组实验大鼠进入开臂次数百分比仍降低，进入开臂滞留时间百分比仅较EC组存在差异，但P值已经接近0.05。

2.3.2 大鼠捕食应激后不同时间拒俘反应性结果表5显示，HK组、SED组大鼠拒俘反应性在电刺激后1、7及30 d时均明显增强。

表4 四组大鼠进入开臂滞留时间／总时间

表5 四组大鼠的拒俘反应性

3 讨论

在前期研究中证实发作间痫样放电确实可引发实验动物短暂学习和记忆能力受损，同时亦观察到SED还可引发实验动物程度更明显、持续时间更长的活动习性改变、警觉水平增高、焦虑不安状态、环境适应能力下降等情绪唤醒障碍［3－4］。鉴于前期研究中的动物模型痫样放电持续时间较短，放电频率少，因此我们通过调整电刺激波宽、频率、串长、刺激强度、串隔与刺激总次数，使SED组大鼠在电刺激停止后1月内均能记录到反复发放的高幅棘、尖、慢波等痫样脑电活动，且无明显的惊厥行为，为进一步探讨反复惊厥阈下电刺激（rSED）对情绪唤醒水平的影响提供了理想的实验动物模型。

旷场实验是经典的行为学实验，能很好的评定动物的情绪性水平以及在开放的陌生环境中的探究行为，可用来测试动物中枢神经系统的“兴奋”或“抑制”状态，是检测实验动物情绪唤醒水平的一种重要方法［9－10］。中央格停留时间是动物对环境适应能力的反映，如果对新环境的适应能力差，则大鼠停留在中央格的时间延长。爬越次数则代表大鼠的兴奋性状态。动物初入陌生环境可出现明显的防护性情感反应，表现为迅速离开中央格，沿周边活动，这对于量化分析实验动物的警觉水平、焦灼状态、环境适应能力等有重要意义。实验结果显示，SED组大鼠电刺激后1、7和30 d内旷场爬越行为明显减少，提示其新环境中运动活性显著降低；拒俘反应性同步显著增强，显示其受惊吓程度严重、冲突特性增强、易激惹、挣扎行为明显；电刺激后1 d及7 d时后肢性站立减少，30 d仍减少，表明其挫折感明显、探究行为显著受抑。由实验结果可见，反复SED可致实验大鼠在新环境中的警觉水平明显增高、易激惹、适应能力显著下降，在刺激后较长时间内一直处于惊恐逃避情感反应中。

高架十字迷宫试验则是以动物自发行为为基础，利用动物对新异环境的探究特性，以及对高悬敞开臂的恐惧感而形成的矛盾冲突状态来评价实验动物焦虑素质特征的［11］，其通过进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比反映动物的焦虑状态，焦虑动物上述指标均明显降低。实验结果显示，电刺激后1 d及7 d，实验大鼠进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比均降低，电刺激后30 d，实验大鼠进入开臂次数百分比仍降低，提示反复SED对大鼠有明显的长时间的致焦虑效应。虽然，电刺激后30 dHK组、SED组大鼠进入开臂时间百分比较EC组仍存在差异，可以说明反复惊厥阈下痫样放电对实验动物焦虑情绪仍存在持续性影响，但差异已经非常微小（P值已接近0.05），同时HK组、SED组大鼠较NC组已经无差异，是否说明电极本身对实验大鼠的影响和痫样放电对实验大鼠的影响产生了“拮抗”作用，尚需进一步观察和讨论。

通过海马反复惊厥阈下电刺激，成功诱发了实验动物明显而持续的运动活性减少、探究行为受抑、警觉水平过高、焦虑不安状态、环境适应能力下降、惊恐逃避反应等多种情绪唤醒障碍。因此，反复SED可能引发包括抑郁、焦虑等更为持久的情感行为异常与社会适应能力下降。反过来我们有理由推测，对于抑郁症、焦虑症等临床患者，无明显痫性发作表现的SED现象亦可能是部分患者的重要发病原因之一。但对反复SED的直接作用能引起何种神经生物学改变尚并不明确，亟待进一步探讨。

［1］Aldenkamp AP，Beitler J，Arends J，et al.Acute effects of subclinical epileptiform EEG discharges on cognitive activation［J］.Funct Neurol，2005，20（1）：23－28.

［2］Holmes GL，Lenck-Santini PP.Role of interictal epileptiform abnormalities in cognitive impairment［J］.Epilepsy Behav，2006，8（3）：504－515.

［3］ 王庆松，张汝，杨仕柏.发作间痫样放电对大鼠情感行为及空间学习记忆的影响［J］.中华神经科杂志，2002，35（1）：36－39.

［4］Wang QS，Wang ZG.Effects of subconvulsive electrical stimulation to the hippocampus on emotionality and spatial learning and memory in rats［J］.Chin Med J，2003，116（9）：1361－1365.

［5］ 包新民，舒斯云.鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社，1991：12.

［6］Bengzon J，Kokaia M，Brundin P，et al.Seizure suppression in kindling epilepsy by intrahippocampallocus coeruleus grafts： evidence for an alphaadrenoreceptor mediated mechanism［J］.Exp Brain Res，1990，81（2）：433－437.

［7］ 向阳，王庆松，郑宇.反复惊厥阈下痫样放电致海马齿状回颗粒细胞树突改变［J］.中国神经精神疾病杂志，2009，35（4）：223－227.

［8］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.Ⅱ.Motor seizure［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32（3）：281－294.

［9］Page GG，Blakely WP，Kim M.The impact of early repeated pain experiences on stress responsiveness and emotionality at maturity in rats［J］.Brain Behav Immun，2005，19（1）：78－87.

［10］Young NA，Wintink AJ，Kalynchuk LE.Environmental enrichment facilitates amygdala kindling but reduces kindling-induced fear in male rats［J］.Behav Neurosci，2004，118（5）：1128－1133.

［11］Doremus TL，Varlinskaya EI，Sppear LP.Age-related differences in elevated plus maze behavior between adolescent and adult rats［J］.Ann N Y Acad Sci，2004，1021：427－430.

（责任编辑：李立）

Recurrent subconvulsive epileptiform discharges facilitate persistent emotionality disorder in rats.

XIANGYang，WANG Qingsong，ZHENG Yu.Department of Neurology，Chengdu General Hospital of Chengdu Military Area Command of Chinese PLA，Chengdu 610083，China.Tel：028－86570712.

Objective To investigate whether or not recurrent subconvulsive epileptiform discharges may facilitate the persistent emotionality disorder in rats.Methods Sixty-two male SD rats aged from 6 to 7 weeks old were selected and divided randomly into 4 groups： SED group（n＝16）for rats with recurrent subconvulsive epileptiform discharges，HK group（n＝16）for hippocampal kindling，EC group（n＝15）for control of electrode，NC group（n＝15）for normal control.The changes in emotionality of experimental rats were tested by locomotor activity，exploratory behavior，capture-resistance and elevated plus-maze（EPM）test at 1，7，30 d after electrical stimulations.Results Compared with the EC group， at 7 d after electrical stimulation，rats in the HK，SED group displayed a significantly decrease in number of creeping（P＜0.01），and the standing on hind limbs，the percentages of open-arm entries and open-arm retention time in EPM test was decresed（P＜0.05），and the difference still existed at 30 day after electrical stimulation（P＜0.05）.And the capture-resistance in rats in the HK，SED group was significantly increased at 30 day after electrical stimulation（P＜0.01）. Conclusions Recurrent subconvulsive epileptiform discharges causes the persistent emotionality as decreased locomotor activities，suppressed exploratory behavior，enhanced startle，delayed habituation，increased anxiety and defense reaction.

Recurrent subconvulsive epileptiform discharges（rSED） Epilepsy Persistent emotionality disorder

R742.1

A

2011－03－14）

☆ 四川省卫生厅科研课题（编号：070389）

* 成都军区总医院神经内科（成都 610083）

△ 成都军区总医院肾脏内科

（E-mail：wqs832001＠sina.com）