中药独活中总香豆素高通量分析方法的建立

李 晋 郭新荣 张秋红 常艳旭

天津市现代中药重点实验室天津中医药大学，天津 300193

独活为伞形科植物重齿毛当归［Ange1ica pubescens Maxim f biserrata Shan et Yuan］的根，是一种常见的中药，具有祛风除湿，通痹止痛之功效，用于风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛，风寒协湿头痛［1］。现代研究表明，独活含有数十种香豆素类化合物，如东莨菪内脂、伞形花内脂、二氢山芹醇、补骨脂素、二氢欧山芹醇乙酸酯，蛇床子素、异欧前胡素二氢欧山芹素等，其中蛇床子素含量最高［1］。

目前，独活总香豆素含量测定方法主要以采用紫外分光光度法为主［2－3］，但该种方法由于每次仅能1－3个样品，具有低通量的特点，不适合大量的样品检测。因此，本试验以蛇床子素为对照品，用多功能读板机，拟建立一种高通量的独活中总香豆素含量测定方法，为独活药材及饮片控制提供一种简单、快速、高通量的分析方法。

1 仪器与试药

AX－105十万分之一天平;BP121S万分之一天平 (德国赛多利斯);SB－1000YDTD超声清洗槽 (宁波新芝科技股份有限公司，40KHZ);微量多功能读板机 (infinite M200);96孔板 (Cos96ft－Corning 96 F1at Transparent)。

蛇床子素对照品 (成都曼斯特生物科技有限公司)，甲醇 (色谱纯)，无水乙醇 (分析纯)，纯水，不同产地独活饮片购买于药材各地药材市场，经作者鉴定为伞形科独活。分别粉碎，过100目筛，密封保存，备用。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备

精密称取减压干燥至恒重的蛇床子素对照品2 mg，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成400 μg/mL的蛇床子素标准液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取独活药材粉末0.125 g，置10 mL具塞试管中，加60%甲醇定容至10 mL，超声40 min，称定重量，声提取40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3 结果

3.1 测定波长的选择

分别精确量取对照品溶液及供试品溶液各0.2 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，在波长为200～400 nm范围内扫描，对照品溶液和供试品溶液均在315～325 nm范围内有明显吸收，吸收峰在320 nm附近，故选择320 nm作为测定波长。

3.2 方法学验证

3.2.1 标准曲线

精密吸取一定量蛇床子素标准液置10m1容量瓶中，加入甲醇稀释得到3、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 μg/m1溶液。以甲醇为空白对照，绘制标准曲线:y=0.0331x－0.0089(r=0.9995)。结果表明蛇床子素质量浓度在3～60ug/m1范围内，呈良好的线性。

3.2.2 精密度

精密吸取8μg/m1对照品溶液200 μ1，加入到96孔板中，320nm波长下测定吸光度，重复测6次，吸光度值RSD 为0.27%。

3.2.3 重复性

取同一批药材6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定总香豆素的含量为2.17%，RSD为1.83%，表明该方法重复性好。

3.2.4 稳定性试验

取供试品溶液0.2 mL，按标准曲线制作方法，分别在1，2，6，8，12，16，24 h测定吸光度，考察样品24 h稳定性。经计算，RSD=0.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.2.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的独活样品粉末约0.05g，共6份，置10 mL具塞试管中，分别加入质量为1086 μg的标准品，按供试品溶液制备方法，制备含对照品的样本溶液6份，测定并计算，结果见表1，平均回收率为98.9%，RSD为 3.00%。

表1 加样回收实验结果

3.3 样品测定

精密称取不同来源独活饮片粉末，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液0.2 mL，按标准曲线制作方法测定其吸光度。利用回归方程求出供试品溶液中折合蛇床子素的浓度 (总香豆素)，并计算独活中总香豆素的含量，结果见表2。

4 讨论

本研究以蛇床子素为对照品，利用多功能读板机，建立了可同时测定96个独活样品中总香豆素高通量含量测定分析方法，并对不同产地的独活饮片进行了总香豆素的含量测定，结果表明该方法简便、准确，适用于中药独活药材中总香豆素含量测定。同时发现不同地区即使相同产地的独活饮片质量存在很大差异;不同批次的独活样品中总香豆素的质量分数在0.95～3.39%，均值2.69%。该研究结果表明了所建的高通量的分析方法简单，稳定可靠，重复性好，可用于独活的质量控制，为独活质量标准的制定提供参考。

表2 不同产地独活总香豆素含量

［1］中国药典 (一部)［S］.2010年版，2010:246－247.

［2］常艳旭，朱子微，李晋，张秋红，秦绪.高效液相色谱法同时测定独活中七种有效成分含量及在质量评价中应用［J］.内蒙古大学学报 (自然科学版)，2011，42(2):121－129.

［3］张恭孝，李聚仓，王德才.独活中总香豆素组分的含量测定［J］.中华中医药学刊，2010，28(12):2647－2648.

［4］但飞君，蔡正军，郭军辉，潘家荣，王力.中药白根独活中总香豆素成分的含量测定［J］.三峡大学学报 (自然科学版)，2008，30(6):91－93.