细胞毒理学在食品领域中的应用

李兵霞，王友升*

(北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048)

细胞毒理学在食品领域中的应用

李兵霞，王友升*

(北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048)

细胞毒理学是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科，它可以用于食品安全毒理学的评价、食品中有害物质的毒作用机理研究、食品加工生产中有毒有害物质的检测、功能性食品中功效成分的活性研究等。细胞毒理学的研究方法有多种，用于探讨外源物对细胞的不同作用，包括对细胞的活性影响和遗传学影响、造成细胞形态学变化以及细胞凋亡检测。目前在食品领域较广泛应用的细胞毒理学方法有MTT比色实验、细胞DNA合成测定法、彗星电泳法、Western blot法、流式细胞术测定法、NRU染色法、免疫细胞化学染色技术等。

细胞毒理学；食品领域；方法

利用动物实验完成对有毒物的毒理学安全性评价是普遍采用的评价方法，但是随着实验数据的积累，人们发现并非所有的动物实验都能准确地预示有害物对人体的危害，却需要牺牲许多的动物，这样从经济和科学的角度考虑，人们利用离体的动物细胞和人的细胞、组织培养等新的研究手段，使选择体外方法替代动物实验成为可能，欧洲很早就提议检测化学物质安全性时除非没有可靠的替代方法才可用动物实验[1]，这不仅是动物权益保护的需要，也彰显着科学的进步、社会经济的发展。在1959年有人提出3R原则即“替代(replacement)、减少(reduction)和优化( refinement)”原则，要善待活着的动物、减少动物死亡的痛苦，从而科学、合理、人道地使用动物[2]；国际组织，如：经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)、欧洲替代方法验证中心(European Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)、 美国机构间替代方法评价协调委员会(the United States Interagency Coordinating Committee for the Validation of Alternative Methods，ICCVAM)等促进了动物替代法的发展[3]，对动物替代法的相关实验进行了验证，OECD还建立了指导性体外替代实验原则Good Laboratory Practice(GLP)[4]，它们共同推动了实验指南的建立和实验条件的国际一体化。毒理实验动物替代法包括基于电脑模拟的方法和体外实验方法[5]，目前动物替代法主要包括细胞培养、器官培养和胚胎培养3种方法，其中细胞培养的发展成就了细胞毒理学这门学科的兴起，细胞毒理学的定义是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科[6]，人们已经建立很多细胞系用于细胞毒理学实验研究，例如利用肝细胞系检测外源物的毒性等[7]。细胞毒理学已经用于食品领域、医药领域、植物组织栽培等，本文着重介绍细胞毒理学及其研究方法在食品领域中的应用研究。

1 细胞毒理学在食品领域中的应用范围

目前，细胞毒理学已经在食品领域的研究中有较为广泛的应用。细胞毒理学利用离体培养的细胞不仅可以研究毒物对靶细胞的毒性及其毒物在细胞中的生物转化，而且还可以研究毒物对靶细胞的作用机制，因此利用细胞毒理学能够评价食品的安全性，检测食品中毒素类物质、金属元素、农药残留、添加剂及食品加工中有毒有害物质等，并探讨它们对细胞的毒效应及作用机制[8-9]。国内外已经有许多学者进行了相关的研究，例如汝少国等[10]以Caco-2细胞紧密连接和PC12细胞乙酰胆碱酯酶活性为指标，建立了采用哺乳动物细胞系Caco-2和PC12细胞检测有机磷农药细胞毒性的新方法，为食品毒理学在农药残留中的研究奠定了一定的基础。隋海霞等[11]使用CHO、CHL细胞利用细胞毒理学实验中性红染色法等对杜仲的毒性进行了快速筛选，获得了杜仲属于无毒性物质的结论。Winkler等[12]利用酶联免疫吸附测定实验研究了食品防腐剂亚硫酸钠和山梨酸对外周血单核细胞的作用，Maier等[13]则用同样的细胞毒理学实验方法研究了食品防腐剂安息香酸钠和丙酸以及着色剂姜黄素对外周血单核细胞的作用，前者结果表明亚硫酸钠和山梨酸可以抑制受刺激的外周血单核细胞中色氨酸的降解和新喋呤的生成，原因是Th1-类型免疫反应受到抑制，后者的结果也显示所研究的食品添加剂能够抑制Th1-类型免疫反应从而作用于外周血单核细胞的代谢。

此外细胞毒理学也可被用来检测功能性食品及其有效活性成分，例如研究食品当中抑癌因子的机制、检测其对癌细胞的抑制活性，Anajwala 等[14]研究了龙舌兰的甲醇提取物、枣槟榔的水提取物、马钱子的甲醇提取物对癌细胞的药理作用，受试细胞是人类MCF-7胸腺癌细胞和Vero细胞系，结果表明枣槟榔的水提取物和龙舌兰的甲醇提取物对癌细胞有强烈的细胞毒性，而马钱子的甲醇提取物没有明显的毒性效应。揭国良等[15]用MTT等方法研究了普洱茶的不同提取物对人胚肺成纤维细胞的作用，细胞已经做过高糖作用处理，结果表明普洱茶乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物中的某些组分对高糖作用下的人胚肺成纤维细胞具有保护作用。

2 细胞毒理学在食品领域中的研究方法

细胞毒理学实验的研究方法有很多种，最为成熟也是在实际当中被很多研究者应用的方法是MTT法，例如用于研究枸杞多糖、番茄红素、莪术油等对癌细胞的抑制作用[16-18]，该方法可以检测细胞活性，但这只是细胞毒理学研究中的一个方面，它需要用多种方法来探讨外源物质对细胞的不同作用，包括对细胞的遗传学影响、造成细胞形态学变化以及细胞凋亡检测等。细胞毒理学的研究方法有很多种，但它们研究发展的完善程度不一样，在实际研究当中并非所有方法都得到了广泛应用，本文着重介绍目前被国内外实验人员较广使用于食品领域中的细胞毒理学实验方法。

2.1 MTT比色实验

MTT比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT是显色剂噻唑蓝的简称，化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐，MTT能被活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色结晶物甲臜，沉积在细胞中，而死细胞则不能。该方法很成熟，许多研究者均利用该实验检测细胞的活力。饮用水中砷含量高时容易引起砷中毒， Bredfeldt[19]利用MTT等体外实验研究了膀胱癌的致癌物三价砷和亚甲基砷酸对人尿道上皮细胞的作用，结果显示亚甲基砷酸比砷(三价)的毒性大20倍，且人尿道上皮细胞可以将砷(三价)生物转化为五价和三价的亚甲基化代谢物。食品中的霉菌毒素会对人体健康造成极大的威胁，例如赭曲霉毒素A(OA)产生于曲霉菌属和青霉菌属，能够污染大米、小麦、咖啡、玉米等农作物，动物摄入后其肝脏、肾脏会受到侵害，严重时可致畸。Mwanza等[20]就用了MTT方法检测了OA对人和猪淋巴细胞的细胞毒性效应。虽然MTT比色实验的应用较为广泛，但并非可以用于所有物质的研究，例如黄酮类中某些物质就不能利用该方法探究其对各种细胞的作用，Peng等[21]通过其实验研究指出在活细胞不存在时毛地黄黄酮、槲皮黄酮也可以减少MTT，这样就会影响这两种黄酮类物质作用于细胞增长的测定结果。

2.2 细胞DNA合成测定法

DNA是细胞遗传的基本物质，它的结构中有4种碱基，其中胸腺嘧啶核苷(TdR)是其特有的碱基。因此用3H-TdR作为DNA合成的前体掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢和细胞增殖的情况。细胞DNA合成测定法可用于研究外源物质对细胞DNA合成的影响，从而阐明它们对细胞的毒性效应。共轭亚油酸cis-9，trans-11CLA是具有生理活性的一种天然产物，它可以抗动脉硬化、提高免疫力、抗癌等作用，Liu 等[22]利用细胞DNA合成测定法等细胞毒理学实验方法研究了cis-9，trans-11CLA对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性作用，结果表明cis-9，trans-11CLA可以阻断细胞周期从而抑制MCF-7细胞的生长和增殖。环孢菌素A是由一种真菌产生的具有生理活性的代谢产物，它是一种理想的免疫抑制治疗剂，Marionnet等[23]在其研究中有对环孢菌素A的免疫抑制评价，比较了用DNA合成测定法和其他方法评价环孢菌素A对正常人体皮肤角化细胞和转染HPV病毒角化细胞的抗增生效应，DNA合成测定法反应了在实验后期16～18h的细胞合成DNA的数量。

2.3 慧星电泳法(SCGE)

在细胞凋亡时，内源性Mg2+、Ca2+依赖性核酸内切酶被激活，对DNA的切割有3种形式，即小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂及DNA单链的断裂。可用于食品、药品、化妆品的芦荟中含有退黑激素(MT)，它是一种吲哚类激素，能够抗氧化、防衰老、有助于免疫系统、消化系统等作用，Bagchi等[24]利用了电泳法等细胞毒理学实验方法研究了褪黑素对巨噬细胞J774A.1细胞的作用，该研究中巨噬细胞J774A.1细胞由于樟脑丸的诱发引起氧化应激和DNA损伤，结果表明褪黑素对受到樟脑丸损害的巨噬细胞J774A.1细胞具有保护作用。该方法还可以用于检测致癌物的细胞毒性作用， Uhl等[25]评估了电泳法检测遗传毒性致癌物对Hep G2肝癌细胞系的毒作用，他们总共检测了12种化合物的毒效应，这些化合物包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄樟油精等，还有一些吡啶类化合物，结果显示有10种化合物致使DNA迁移显著增加，该文的作者还将其所得结果与早期的相关实验进行了比较，表明Hep G2/SCGE方法用于预测基因毒性是很有前景的。

2.4 蛋白质印迹法(Western blot法)

Western blot法是分析细胞蛋白质表达的一种生物学技术，它是将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。利用该方法可以研究外源物对细胞中遗传物质的毒性效应。柚皮素是一种天然的苦味物质，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗动脉粥样硬化等作用，Park等[26]运用了Western blot法以及其他细胞毒理学实验方法，研究柚皮素对癌细胞MCF-7的细胞毒作用，结果表明柚皮素抑制MCF-7细胞的强弱依赖于本身剂量的大小，作者综合多种方法探讨柚皮素的抑癌作用机理，柚皮素能够诱导内源性活性氧(ROS)产生，活化p38、SAPK/JNK/1/2、c-Jun的信号途径，p38、SAPK/JNK/1/2、c-Jun在细胞激素和氧化应激下能够造成细胞生长遏制以及细胞凋亡，同时柚皮素降低了诱导细胞生长的因子P-Erk1/2水平。漆叶富含黄酮类物质，常常被用作食品添加剂和抗菌药剂，从漆叶中提取的黄酮类物质(RCMF)能够抑制人体骨肉瘤细胞的生长并诱导其死亡，Kook等[27]对此进行了机理研究，方法包括Western blot、MTT等毒理学实验，RCMF诱导人体骨肉瘤细胞凋亡与p-53介导的线粒体应激反应以及与因子AIF和EndoG的细胞核转运有关，AIF和EndoG是诱导细胞凋亡的相关因子，它们的转运又受到Bcl-2、Bax、细胞色素c的影响，而RCMF能够通过诱导p53降低Bcl-2的水平、活化Bax、造成细胞色素c的释放，最终RCMF可以诱导人体骨肉瘤细胞凋亡。

2.5 流式细胞术测定法

流式细胞术在食品工业当中已经是用于检测食品微生物的一种非常有用的工具，它可以通过同时检测膜完整性和酶活、膜电势、呼吸活性、胞内pH值等来研究微生物细胞，在食品微生物中主要用于测定微生物菌群的活力和细胞计数、腐败菌和病原菌污染的检验、益生菌的活力检测等[28]，Veal等[29]也在其文献中阐述了将细胞流式术及荧光染色用于检测微生物细胞，包括监测水、食物和饮料中的微生物。流式细胞术还可以用于检测功能食品中活性成分对人体细胞的作用。长链多不饱和脂肪酸存在于很多植物当中，它有多种生理活性功能，在食品当中多作为营养强化剂，Mukaro等[30]运用流式细胞术的检测方法研究了食用添加ω-3长链多不饱和脂肪酸的强化食品后，人体中红细胞膜脂质中长链多不饱和脂肪酸的变化是否间接参与抗炎症的作用，即与有助于抗炎的白血球数量和功能改变是否相关。除此外，还可以用于检测食品中有害因子对机体细胞的毒害作用，例如Lag等[31]利用了流式细胞术以及其他毒理学实验研究了镉诱导原生上皮肺细胞死亡的作用机理，该研究指出镉诱导的细胞凋亡与p53和Bax有关，不涉及氧化代谢途径。

2.6 其他方法

在食品领域研究中常见的方法还包括中性红摄取(neutral red uptake，NRU)细胞毒理学实验和免疫细胞化学染色技术。NRU实验在许多研究当中被用来检测外源物对细胞生活力的影响，人们用此方法可以研究食品中活性成分的功效、食品中有害因子的细胞毒效应以及食品添加剂对机体细胞的毒性作用等。例如Jeong等[32]利用NRU、MTT等细胞毒理学实验，研究了山茶叶的水提取物对神经元细胞PC12的保护作用，Handrich等[33]利用该方法检测了未知霉菌毒素对机体细胞的毒性效应，Vaucher 等[34]就研究了杀菌剂多肽P40对绿猴肾细胞的毒效应。

免疫细胞化学染色是把血清学方法和显微示踪方法结合起来的一类技术，根据标记物的种类不同，可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术及放射免疫自显影法等。该技术可以研究细胞的形态学变化以及胞内代谢物，已有国内外的学者将其用在食品领域中的研究，例如Weaver等[35]利用免疫细胞化学染色技术探究了致癌物苯对上皮肺癌细胞凋亡的诱导效应及作用机理，林明华等[36]用免疫酶染色法和MTT法，研究了从苦参根等植物中提取的生物活性成分氧化苦参碱对小鼠皮肤成纤维细胞NIH3T3增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。

3 结 语

我国传统的食品安全性毒理学评价是利用动物进行的体内实验，这样费时、费力、费财，而随着实验动物使用的4Rs (减少、替代、优化和可靠) 原则的倡导与实施，毒理学替代法成为有价值的研究新手段，所以细胞毒理学这门在毒理学研究领域中衍生出的新兴学科，在食品毒理学安全性评价中的研究与应用越来越受到人们的青睐和关注。细胞毒理学作为动物活体实验的替代法之一，在食品领域的相关研究具有很好的发展前景。

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Application of Cytotoxicology in Food Industry: A Review

LI Bing-xia，WANG You-sheng*
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Cytotoxicology has been used to study the actions and mechanisms of exogenous substances on the damage of living cells. It can be applied to assess food safety, study the mechanisms of toxicity, detect hazardous substances in food processing and examine functional food ingredients. Currently, cytotoxicologic methods such as MTT colorimetric assay, DNA synthesis assay, comet electrophoresis, Western blot method, flow cytometry assay, NRU staining, immunocytochemical staining are being applied in food industry.

cytotoxicology；food industry；methods

R994.4

A

1002-6630(2011)17-0384-04

2011-06-27

北京市科技新星项目(2007B011)；北京市属高等学校人才强教计划资助项目(PHR201108082)

李兵霞(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：lilanhaoyang@126.com

*通信作者：王友升(1976—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：wangys@th.btbu.edu.cn