仿刺参肠道多糖的纯化及理化分析

林威威，张 健，王茂剑,*，常耀光，王共明

(1. 上海海洋大学食品学院，上海 200000；2. 山东省海洋水产研究所，山东 烟台 264006；3. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

仿刺参肠道多糖的纯化及理化分析

林威威1,2，张 健2，王茂剑2,*，常耀光3，王共明1,2

(1. 上海海洋大学食品学院，上海 200000；2. 山东省海洋水产研究所，山东 烟台 264006；3. 中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

目的：对仿刺参肠道多糖进行纯化，并对纯化产物进行理化分析。方法：使用葡聚糖凝胶(G-100)层析柱分离出两种仿刺参肠道多糖，选取其中多糖A进行研究。使用葡聚糖凝胶(G-100)柱层析法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度检测，葡聚糖凝胶(G-200)柱层析测定分子质量，高效液相色谱法确定其单糖组分，并结合红外吸收光谱法与核磁共振对其结构进行初步检测。结果：实验所得纯化产物多糖A为均一组分，主要含有氨基糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐和岩藻糖3种单糖，并含有少量的氨基葡萄糖、半乳糖。其中岩藻糖有α和β两种构型，以α-岩藻糖硫酸酯残基、β-岩藻糖硫酸酯残基形式存在。分子质量约为18.8×104D。结论：该纯化产物多糖A为一种酸性多糖，推测其为硫酸软骨素类。

肠道多糖；纯化；单糖分析；结构鉴定；仿刺参

多糖是存在于自然界的醛糖和酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，广泛存在于各种生物体中，是生命活动的基础物质之一，在生命活动中发挥着重要的作用。研究显示[1]，多糖具有抗肿瘤活性、抗病毒、降血糖、抗炎、抗补体、抗辐射及解毒等生物活性。海参多糖是海参体内最重要的活性物质之一，存在于海参体内的多糖主要分为两类，一类为海参糖胺聚糖或黏多糖，另一类为海参岩藻多糖。海参多糖的提取纯化技术已较为成熟，但研究对象大多针对海参体壁。本实验基于对海参体壁多糖研究的较为成熟的技术，对仿刺参肠道多糖进行提取纯化研究。主要针对纯化技术进行参数确定，制备出仿刺参肠道纯化多糖，对其进行成分鉴定及结构分析，为进一步的功能性质鉴定提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜仿刺参肠，产于山东省烟台市。

葡聚糖凝胶(Sephadex G-100)、葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)；葡聚糖标准品(Dextran Standard 1.2×104、5 × 104、15 × 104、27 × 104D)；D-甘露糖 (Man)、D-(+)-氨基葡萄糖(GlcN)、D-氨基糖醛酸(GlcUA)、D-(+)-半乳糖醛酸(GalUA)、乳糖(Lac)、D-(+)-氨基半乳糖盐酸盐 (GalN)、D-半乳糖 (Gal)、L-阿拉伯糖(Ara)、L-岩藻糖 (Fuc)标准品 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Aglient1100型高效液相色谱仪(配有ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱4.6mm×150mm，5μm) 美国Agilent公司；Bruker AVANCE III 600 超导高分辨核磁共振谱仪、Bruker TENSOR 27傅里叶红外光谱仪 德国Bruker光公司；TU-1810PC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Hel-VAP旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；FDU-1200冷冻干燥机 日本Eyela公司；DYY-12C型电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 仿刺参肠道多糖分离纯化

取新鲜参肠，洗净后用筛沥水至无水滴下，投入组织捣碎机捣碎，匀浆。使用木瓜蛋白酶解法[2]提取，加酶量10400U/g，55℃条件下酶解6h，90℃条件下灭酶15min。将粗多糖溶液进行减压蒸发浓缩，取浓缩液加入1/2体积50% 的三氯乙酸(TCA)溶液，静置过夜。再于15000r/min条件下离心15min，取上清液加入醋酸钾使其浓度达到1.5mol/L，于4℃条件下静置过夜，15000r/min离心15min，收集沉淀，无水乙醇洗涤，得精制肠道多糖。

精制后肠道多糖使用柱层析法[3-5]进行纯化。肠道精制多糖用蒸馏水复溶成1.5mg/mL水溶液，取2mL上样至Sephadex G-100层析柱中，去离子水洗脱，恒定流速0.25mL/min，自动部分收集器收集，每管2mL，共收集80管。苯酚硫酸法[6-7]检测所收集溶液吸光度，按不同出峰分别采收，冷冻干燥得海参肠道纯化多糖。

1.3.2 纯度测定

采用凝胶柱层析与琼脂糖凝胶电泳法同时检测，凝胶柱层析法如1.3.1节中所述。

琼脂糖凝胶电泳[8]分析：缓冲液：0.06mol/L pH8.6巴比妥缓冲液；固定剂：0.1g/100mL十六烷基三甲基溴化铵溶液；染色液：以脱色液为溶剂配制0.1g/100mL甲苯胺蓝溶液；脱色液：V乙酸:V乙醇:V水＝0.1:5:5；电泳条件：200mA条件下电泳60min。

称取0.24g琼脂糖加入30mL巴比妥缓冲液中，加热制胶。将纯化样品配制成4mg/mL的溶液，取两平行(一加溴酚蓝示踪剂，一为单样物质)，上样8μ L。电泳结束后固定剂中固定1h，蒸馏水冲洗胶体表面，冲洗后置于甲苯胺蓝溶液中染色10min，再以脱色液漂至背景无色。

1.3.3 分子质量测定

葡聚糖标准曲线制作：将分子质量分别为1.2×104、5×104、15×104、27×104D 的葡聚糖标准品配制成1mg/mL水溶液，使用Sephadex G-200色谱柱依次上柱，上样量为1mL，去离子水洗脱，流速0.35mL/min，自动收集器收集，苯酚硫酸法检测，分别得各自洗脱体积Ve，27×104D洗脱体积作为外水体积Vo，以Ve/Vo为纵坐标，lgM为横坐标，绘制标准曲线[9-10]。

取纯化多糖以相同条件过柱，并收集计算洗脱体积，通过对比标准曲线计算分子质量。

1.3.4 单糖组成测定

采用柱前衍生高效液相色谱法[11-13]。

单糖标准品衍生物的制备：将M a n、G l c N、GlcUA、GalUA、GalN、Gal、Ara、Fuc 8种单糖标准品和内标物Lac配制成约0.36g/L的溶液，分别吸取50μL加入试管中，然后加入450μL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和等体积的0.3mol/L NaOH溶液，漩涡混匀，于70℃水浴中反应30min，取出冷却至室温，用450μL 0.3mol/L HCl溶液中和，加入1mL氯仿萃取，充分振荡，吸弃下层有机相，重复3次。将上层水相过膜，取1 0μL进样。

样品制备[14]：称取纯化样品2.0mg于安培瓶中，加入1mL 2mol/L 三氟乙酸(TFA)，充氮气封管，于110℃水解8h。冷却至室温，5 0℃挥干TFA，逐次以2、0.3mol/L NaOH溶液缓慢调至中性，定容至1mL，取其中400 μ L并混入50 μ L内标物Lac进行PMP衍生化。具体方法同上所述。

色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪，搭配ZORBAX Eclipse XDB-C18分离柱(4.6mm×150mm，5 μ m)，紫外检测器(254nm)；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；流动相A：15%乙腈+0.05mol/L磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH，pH6.9)；流动相B：40%乙腈+0.05mol/L磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH，pH6.9)；时间梯度：0→10→30min；浓度梯度：0→8%→20%流动相B；进样体积：10μ L。

1.3.5 波谱测定

红外光谱：采用KBr压片法进行红外光谱扫描，取纯化样品1mg，与200mg KBr混合研磨，压片后，再以傅里叶变换红外光谱仪进行扫描，扫描波数范围为4000～400cm-1。

核磁共振(NMR)：称取样品50mg，0.5mL D2O溶解后，场强600MHz，上机分析。

2 结果与分析

2.1 仿刺参肠道组织精制多糖柱层析

仿刺参肠道组织精制多糖经Sephadex G-100洗脱后，根据苯酚硫酸法检测，以收集管号为横坐标，吸光度为纵坐标作图。

图1 仿刺参肠道组织精制多糖Sephadex G-100柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution curve of purified polysaccharides from intestinal tract of Apostichopus japonicus

如图1所示，仿刺参肠道精制多糖经过柱层析后，产生两个显著峰A和B，两峰无重叠无拖尾，分离效果较好。本实验以峰A为研究对象进行分部收集，经冷冻干燥后得到纯化多糖A，称质量后计算其提取率为0.4‰(B得率相对较少，目前仍在收集过程中)。

2.2 纯度测定结果

图2 仿刺参肠道组织纯化多糖Sephadex G-100柱层析图Fig.2 Gel column chromatography curve of polysaccharide A

如图2所示，精制多糖经过层析柱纯化后出峰单一集中，说明分子质量大小属于同一范围的多糖被集中洗脱出来。

图3 仿刺参肠道纯化多糖琼脂糖凝胶电泳图Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of polysaccharide A

如图3所示，第5与第8泳道上两点均为多糖A的琼脂糖凝胶电泳扫描，其中第5泳道上点为添加溴酚蓝示踪剂的平行样，第8泳道上点为多糖A单物质。两点均清晰无拖尾，说明多糖A为均一成分，纯度可达到电荷均一。

图4 葡聚糖分子质量标准曲线Fig. 4 Calibration curve for relative molecular weight determination

2.3 分子质量测定结果根据图4标准曲线计算，海参肠道纯化多糖A的分子质量约为18.8×104D。

2.4 单糖组分测定结果

图5 单糖标准品高效液相色谱图Fig. 5 HPLC of standard monosaccharides

图6 样品单糖组分高效液相色谱图Fig. 6 HPLC of monosaccharides in polysaccharides A

表1 仿刺参肠道纯化多糖组分分析Table 1 Monosaccharide composition analysis of polysaccharides A

结果如图5、6及表1所示。仿刺参肠道纯化多糖A主要由氨基糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐和岩藻糖等3种单糖组成，其含量分别为28.098%、23.430%、37.644%，并含有少量的氨基葡萄糖(5.988%)、半乳糖(3.181%)，微量的甘露糖和阿拉伯糖。多糖A的单糖组分与构成海参硫酸软骨素的单糖种类相符[15]，因此可推测多糖A为硫酸软骨素类多糖。

2.5 红外图谱分析

图7 纯化产物红外吸收光谱Fig. 7 Infrared absorption spectrum of polysaccharides A

根据参考文献[16-19]分析，3447.74cm-1为－OH特征吸收峰，表明存在分子间、分子内氢键，2925.22cm-1处为C—H的伸缩振动，此两组峰为多糖的特征峰；2000～1500cm-1是双键伸缩振动区，其中1636.34cm-1可能是C＝O的伸缩振动峰；1500～1300cm-1区域主要提供了C－H弯曲振动的信息；1250.11cm-1是S＝O的伸缩振动，818.88cm-1处出现C－O－S拉伸振动吸收峰，表明该糖含有硫酸酯基；1200～1000cm-1为吡喃糖环的C－O伸缩振动所引起的，其中1165.91cm-1处为C－O－H的振动峰，1029.70cm-1归属于糖环上C－O－C的伸缩振动；963.43、928.98cm-1显示了环的骨架振动；902.61cm-1处可能是β-型吡喃糖环C－H变角振动引起的。因此认为多糖A可能为一种含硫酸酯基的β-吡喃多糖。

2.6 核磁共振分析

图8 纯化产物13C核磁共振图Fig. 8 13C nuclear magnetic resonance spectrum polysaccharides A

结合参考文献[18-22]，根据13C的DEPT-135°图谱(图8)，57 ×10-6～104×10-6范围的碳信号表明吡喃糖的存在，δ=100以上糖信号显示着半乳糖或岩藻糖的存在，δ=16附近信号的存在证实α-岩藻糖残基的存在，61×10-6～81 ×10-6的信号是岩藻聚糖C2、C3、C4的信号峰，并且存在着取代基，如硫酸酯键或糖苷键。20×10-6～57×10-6是β-岩藻糖残基上的C6的CH3信号峰，另外，岩藻糖的α构型和β构型在δ=100.0223、δ=101.2482、δ=104.2701也得到了体现。

δ=57.8254处的负峰则对应－CH2OH基团，推测分子内存在半乳糖残基，δ=175.3181表明了多糖A中含有－COOH。从DEPT-135°碳谱进一步推测分子内存在半乳糖残基和半乳糖醛酸残基。

图9 纯化产物1H核磁共振图Fig. 9 1H nuclear magnetic resonance spectrum of polysaccharides A

依据氢谱(图9)，1.1×10-6～1.2 ×10-6和3.5×10-6～5.5×10-6信号能归属于α-岩藻糖残基，相对应的δ=1.9附近的信号峰和3.5×10-6～ 5.5×10-6的信号能归属于β-岩藻糖残基，δ=1.0附近信号应为－CH3的质子峰。该结果和碳谱的信号峰相一致。

结合红外光谱、碳谱以及氢谱的信号综合分析，该分子内存在α-岩藻糖硫酸酯残基、β-岩藻糖硫酸酯残基、半乳糖残基和半乳糖醛酸残基。

3 结 论

通过实验发现，葡聚糖G-100对纯化仿刺参肠道多糖效果良好，能够分出两个不重叠无拖尾的多糖峰，其中纯化多糖A的提取率为0.4‰，纯度检测结果证实多糖A分子质量集中分布，具有电荷均一性。对肠道多糖A成分进行了单糖组分分析，其中主要含有氨基糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐和岩藻糖3种单糖，还有少量的氨基葡萄糖、半乳糖，微量的甘露糖和阿拉伯糖。波谱分析结果与高效液相所检测单糖组分相吻合，且可知多糖A中岩藻糖存在α和β两种构型，以α-岩藻糖硫酸酯残基、β-岩藻糖硫酸酯残基形式存在，为一种酸性黏多糖，推测属于硫酸软骨素类。肠道多糖中另一分子质量较小的B成分仍需继续研究。

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Purification and Physicochemical Analysis of Polysaccharides from Intestinal Tract ofApostichopus japonicus

LIN Wei-wei1,2， ZHANG Jian2， WANG Mao-jian2,*，CHANG Yao-guang3，WANG Gong-ming1,2
(1. College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China；2. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province, Yantai 264006, China；3. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To purify and physicochemically analyze polysaccharides from the intestinal tract ofApostichopus japonicus. Methods: Two polysaccharides, named as polysaccharides A and B, respectively, were isolated and purified by using SephadexG-100 column from the intestinal tract ofApostichopus japonicus, and polysaccharide A was selected to study its physicochemical properties. Its purity was evaluated by SephadexG-100 column chromatography and agarose gel electrophoresis.The relative molecular mass was determined by Sephadex G-200 column chromatography. Monosaccharide components were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and their structures were identifiedby infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance. Results: The purified polysaccharide A was composed of GlcUA, GalN, Fuc, and a small amount of GlcN and Gal. Fucose had two configurations including the forms ofα-fucose sulfate andβ-fucose sulfate residues. This polysaccharide had a relative molecular mass of approximately 18.8 × 104D. Conclusion: The purified polysaccharide A is an acidic polysaccharide, suggesting that it belongs to the chondroitin sulfate class.

intestinal tract polysaccharide；purification； component analysis；structure identification；Apostichopus japonicus

TS254.1

A

1002-6630(2011)17-0118-05

2011-06-30

国家海洋局海洋公益性行业科研专项(201105029)；国家海洋局海洋经济规划科技推进平台与运作项目(国海科字[2007]219)

林威威(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail：742239054@qq.com

*通信作者：王茂剑(1964—)，男，研究员，本科，研究方向为食品科学与工程。E-mail：wangmaojian@126.com