亮氨酸对肉鸡肠上皮细胞TOR基因表达调控的研究

王瑞贺 李然 韩静娅 史卫平 丁显涛 刘宁

河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003

雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)是一类进化上十分保守的Ser/Thr蛋白激酶，属于磷酸肌醇相关激酶家族成员，广泛存在于各种生物细胞中。TOR也是一种重要的信号分子，在调节细胞生长和细胞周期中起到中枢作用。它能够激活下游信号传导通路，通过4E-BP1、S6K等翻译调节因子的磷酸化作用来传递外界营养状况、生长因子等信号，从而调节细胞内核糖体的发生、蛋白质的合成等生理过程，进而综合调控细胞的生长、增殖、凋亡和自噬。TOR信号是营养、化学和运动等因素导致细胞生长和分化的一个关键信号，生长因子、营养素、能量、应激以及雷帕霉素(Rapamycin)等因素可以调控TOR信号活性。

氨基酸通过TOR信号调控蛋白质合成和细胞生长，是最重要的功能性营养素，尤其亮氨酸(Leu)在蛋白翻译起始和刺激蛋白质的合成中起着独特的作用，可激活新生动物骨骼肌TOR，但其对蛋白质合成的激活作用还依赖于其它氨基酸的有效性。肠上皮细胞(Intestina1 Epithe1ia1 Ce11，IEC)在营养素吸收、转运以及营养与生长信号整合方面发挥着重要作用，而关于Leu对IEC中TOR信号活性的影响缺乏报道。本文旨在研究不同浓度亮氨酸对体外培养的肉鸡IEC中TOR信号mRNA表达的影响，为探讨氨基酸调控蛋白质合成的作用机制及建立精确的营养供给技术提供理论基础和开创性思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DMEM培养基、TRIZOL试剂购自Gibco(美国)；胰蛋白酶、EDTA、亮氨酸购自 Sigma(美国)；同胎牛血清(FBS)购自 At1anta Bio1ogica1s(美国)；RT-PCR试剂盒购自Fermentas，其余试剂均为分析纯。CO2培养箱购自上海一恒公司 (BPN-150CRH 中国)，PCR仪Techne(TC-412 英国)。

1.2 细胞分离与培养

选用发育正常的18日龄AA肉鸡胚胎20枚，对照组和实验各组分别包括5枚鸡胚，无菌摘取肠道组织，分别分离并鉴定IEC。IEC细胞在37℃、10%CO2、90%O2、90%相对湿度的CO2培养箱中培养，培养基为DMEM，给予10%小牛血清，100U/m1青霉素，100U/m1链霉素。对照组不含 Leu(0mM)、 实验 I、II、III和 IV 组分别含 Leu 50mM、100mM、150mM和200mM。原代IEC细胞与对照组和各实验组在37℃条件下共孵育2h(n=5)后，收集细胞。

1.3 RT-PCR扩增

对收集的细胞进行总RNA抽提，并紫外分析检测所抽提RNA的纯度。根据Genbank登录的鸡TOR基因和鸡β-actin基因为模板，采用Primer prem ier软件设计引物 (表1)。采用两步法RTPCR：(1)逆转录反应获得细胞cDNA；(2)PCR反应，采用内对照β-actin和目的基因TOR特异性引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，照相。以β-actin为内参，对各组基因扩增产物的电泳条带进行光密度扫描。

表1 基因扩增的引物信息

1.4 统计分析

定量数据为TOR基因与β-actin基因表达量的比值，以均数±标准差表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两两组间多重比较采用邓肯氏检验。采用SPSS 11.0软件进行统计分析。以P﹤0.05为差异具有显著性。

2 结果

用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳图条带清晰，实验II组(Leu，100mM)和III组亮度高，实验 I组(Leu，50mM)和 IV 组(Leu，200mM)条带亮度较低，对照组条带几乎看不到，表明实验II组和III组鸡胚IEC中TOR基因mRNA表达丰度较高，而实验I组和IV组表达量较低。

根据鸡TOR基因mRNA扩增产物电泳带的光密度和内标基因β-actin光密度的比值，得到TOR基因mRNA表达的相对量，见图2。实验组Leu表达量相对比值均显著高于对照组(P﹤0.05)。4个实验组中，II组和III组显著高于I组和IV组(P﹤0.05)，但II和III组之间差异不显著 (P≥0.05)。说明Leu能显著提高鸡IEC中TOR基因表达，以100mM和150mM效果最好。

图2 Leu对鸡胚IEC中TOR与β-actin基因比值的影响，实验I-IV组Leu浓度分别为50mM、100mM、150mM、200mM

3 讨论

动物对生长信号和营养感应是通过一系列信号途径来整合的，其中TOR信号是最重要的细胞信号，该信号是在转录和翻译水平调节细胞生长和蛋白合成的中枢。TOR根据细胞环境的营养条件做出相应的应答，参与调控蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性，从而控制与蛋白质合成和基因转录相关基因的表达。外界营养条件如碳源和氮源能刺激细胞的生长。在TOR作用条件下，当营养物质或其他的生长刺激出现时，细胞主动上调大分子物质的合成，促进细胞生长；相反地，为适应营养限制或其他应激，细胞能够抑制大分子物质的合成和提高物质周转量。

营养因素对TOR活性具有显著的上调作用，而抗营养因子对其具有下调作用。Du et a1.(2005)发现对奶牛限饲降低了骨骼肌细胞中TOR信号活性。Liu et a1.(2008)报道植酸显著下调了TOR在肉鸡小肠中的mRNA表达，表明植酸降低了细胞的营养信号、蛋白合成以及细胞生长。Leu在蛋白翻译起始和刺激蛋白质的合成中发挥着重要作用。W i1son等(2010)研究表明长期静脉注射Leu激活了新生动物骨骼肌TOR，但其对蛋白质合成的激活作用还依赖于氨基酸的有效性。

IEC起源于肠上皮干细胞的分化，肠上皮干细胞位于陷窝基底部，是一类具有自我更新、高度增殖、不对称性分裂和多向分化潜能的细胞。IEC是肠道内主要的功能细胞，参与肠道食物的消化、吸收及内外分泌，构成体内的免疫屏障，调控体内免疫水平，并阻止微生物及毒素对肠道的侵袭。因此，促进IEC的分裂增殖，在维持肠道粘膜正常结构、功能和代谢等方面具有重要的作用。但是，关于营养介导的IEC中TOR信号活性的研究尚无报道。本研究中，Leu显著提高了TOR基因在体外培养IEC中的表达，表明Leu促进了IEC的分裂增殖，并且培养液中Leu的最佳浓度为100～150mM。但是，由于体内环境的复杂性，该浓度范围在体内研究中是否具有类似效果，值得进一步研究。另外，Leu与肠道的功能物质谷氨酰胺和以小肠为主要代谢场所的精氨酸之间是否具有互作效应也值得进一步研究。

4 结论

Leu具有显著提高TOR基因在体外培养IEC中的表达作用，表明Leu能够促进IEC的分裂增殖，其中Leu在培养液中的最佳浓度为100～150mM。

（略）