10味中草药对金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验

（长江大学动物科学学院，湖北 荆州434025）

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus）可引起多种畜禽疫病，临床最常见的有败血症、关节炎、乳房炎、皮肤、组织器官化脓性感染及蜂窝织炎等。鸡金黄色葡萄球菌性关节炎是鸡葡萄球菌病中常见的一种。鸡、鸭常因趾、蹼或腿部被铁丝、碎玻璃等杂物划伤而感染金黄色葡萄球菌[1]，从而导致关节肿大、跛行，行走困难，采食和饮水受到极大影响，病鸡逐渐消瘦、脱水，最终死亡。该病是一种条件性、环境性疾病，对肉鸡育成期的影响极大，常可由此带来巨大的经济损失。

目前，临床上主要还是使用抗菌药物来控制鸡金黄色葡萄球菌病，但由于广泛、大量、长期不规范地使用抗生素而导致该菌的耐药性大幅度提高，防治效果越来越差，并导致药物残留和一些药源性疾病，严重威胁着食肉安全[2]。近年来，国内外研究者在科学实验和生产实践中，运用中兽医学理论，开发利用中药资源，取得了一定的成绩。中草药对病原菌的体外抑菌试验陆续有研究报道[3]。为了全面了解中草药对畜禽金黄色葡萄球菌的抗菌效果，笔者选用10味中药单方对从患病鸡病料中分离鉴定的金黄色葡萄球菌进行了体外抗菌试验，旨在了解这些中药的抗菌效果，为该病的临床用药及研制开发中草药方剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试中草药及单味药液的制备

中草药金荞麦、黄连、连翘、大青叶、菊花、金银花、蒲公英、板蓝根、鱼腥草、紫苏等购自湖北省荆州市弘卫大药房。

将以上10种中草药分别称取100g，加水1～2L，浸泡30min后煎煮，煮沸后文火煎30min，过滤，药渣再加水0.5～1L，按上述方法进行再次操作后过滤。合并2次滤液，用文火浓缩至100ml，即认为药液中生药的含量为1g／ml。高压灭菌后置4℃冰箱保存备用。

1.1.2 供试菌株及培养基

供试菌株为由某种鸡场自然患关节炎病鸡的关节腔内分离，经纯化、鉴定后保存的金黄色葡萄球菌菌株。按常规方法配制牛肉汤和普通琼脂培养基。

1.2 方法

1.2.1 供试菌株的复苏与纯化

供试菌株临用前经高盐甘露醇琼脂2次纯化培养后，接入营养琼脂内培养24h，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。用灭菌的生理盐水将菌苔洗脱下来，采用平板表面涂布法计数并稀释至浓度为109cfu／ml，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 供试中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径的测定

无菌条件下将涂布有菌悬液的基础培养基平板等间距对称地用外径6mm的硬塑料管打4个孔，挑出孔中培养基，并在酒精灯火焰上对培养平板封底，将各种供试中草药用蒸馏水按2倍稀释法稀释成1.00、0.50、0.25、0.125、0.0625g／ml 5个浓度，吸取药液50μl加入孔中，每种中草药每个浓度设3个重复，然后将培养平板放入37℃温箱培养24h后用游标卡尺测量抑菌圈直径，同种中草药同一浓度取其抑菌圈直径的平均值，此即各种中草药在不同浓度下对供试菌株的抑菌圈直径[4]。

参考NCCLS推荐的标准进行判断[4]。以抑菌圈直径＞20mm为极敏，抑菌圈直径在15～20mm之间为高敏，抑菌圈直径在10～14mm之间为中敏，抑菌圈直径＜14mm为低敏，无抑菌圈为耐药。

1.2.3 供试中草药对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定

采用试管两倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC）。本法是用培养基将药物按两倍递减稀释法稀释成系列浓度，依次分装在一系列的容器中，于各容器内加入对该药敏感的试验菌，经过一定时间和温度的培养，观察各容器中试验菌生长状况而得出药物的最低抑菌浓度。

将按1.1方法制备的供试中草药的单味药液(生药含量为1g／ml）用普通肉汤培养基稀释5倍后（即药液浓度为200mg／ml），再按倍比稀释法稀释至29共10个稀释度。第1管至第9管药物浓度（mg／ml）分别为200×20、200×2-1、200×2-2、200×2-3、200×2-4、200×2-5、200×2-6、200×2-7、200×2-8。然后将上述盛有含药培养基的试管在121℃下高压灭菌30min，冷却，备用。将试验菌接种于基础培养基上，在37℃培养18h，然后用灭菌生理盐水将菌苔洗下，制成菌悬液，控制其浓度为109cfu／ml。吸取20μL的菌悬液于1～10管不同浓度的含药培养基中，11和12管分别为不加中草药液的阳性对照和加药液不加菌悬液的阴性对照，摇匀后置于37℃的恒温箱中孵育20h，观察细菌生长情况，每种药物设2个平行[3]。

判定标准：首先在观察阳性对照管长菌呈浑浊状，而阴性对照管不长菌、呈透明状的前提下，再观察其他试管的浑浊情况，以判断不同浓度药液的抑菌作用，如试管内呈浑浊，证明有细菌生长，用“＋”表示；如试管内澄清透明，证明无菌生长，用 “-”表示。以眼观不浑浊试管的最低药物浓度作为该药的MIC；若药液色素太深，从中取一环接种于普通培养基上，培养后再进行观察[3]。

1.2.4 最低杀菌浓度(MBC）的测定

自上述各管中挑取培养液1环，分别接种于普通琼脂培养基，置37℃恒温箱内培养24h后观察结果。凡在相应培养皿上无金黄色葡萄球菌生长者，表明细菌被药物杀死，以无菌生长的最高药物稀释度为该药对供试菌株的MBC[3]。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌的培养特性和形态、染色特征

供试菌株在普通琼脂平板上均长出表面湿润、光滑、圆形隆起、粘稠不易挑起的小菌落，菌落的颜色为金黄色、黄白色或柠檬色不等，直径1～2mm，有的可达4～5mm。涂片、染色、镜检后发现光镜下均为革兰氏阳性小球菌，成对、短链状或呈葡萄串状排列，链的长短不一，形状各异。

2.2 供试中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

10种中草药对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表1。由表1可知，所选的10种中草药中，黄连的抑菌效果最好，在稀释浓度为0.125～1.00g／ml之间时均显示极敏，在稀释浓度为0.0625g／ml时其抑菌圈直径为18mm(高敏）。其次是大青叶，在稀释浓度为1.00g／ml时其抑菌圈直径为21mm(极敏）。抑菌效果最差的是板蓝根，在试验设定的稀释浓度下没有出现明显的抑菌圈。

表1 10味中草药对1株鸡源性金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

2.3 供试中草药对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC

本试验所选用的10种中草药对临床分离的金黄色葡萄球菌的体外抗菌试验结果MIC和MBC分别见表2和表3。由表2可知，所选的10种中草药中，对临床分离的金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显的是黄连、连翘和大青叶，其MIC均为12.5，其次是菊花，而板蓝根的抑菌效果最差，在试验设定的浓度下没有出现明显的抑菌效果。

表2 10味中草药对1株鸡源性金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度

由表3可知，所选的10种中草药中，对临床分离的金黄色葡萄球菌的杀菌效果最明显的是黄连，其MBC为12.5，其次是大青叶，其MBC为50.0。而金银花、板蓝根、鱼腥草、苏紫这4种中草药在试验设定的浓度下无明显的杀菌效果。

表3 10味中草药对1株鸡源性金黄色葡萄球菌的最低杀菌浓度

3 讨论与小结

中草药作为我国的优势国药，具有抗菌、消炎、不易产生耐药性、低毒、低残留、可增强机体免疫力等特点，受到了广泛的关注，而且我国中草药资源丰富、品种齐全，而且毒副作用小、价格较低、加工方便，因此，研究中草药的抑菌效果及抑菌机理具有积极的临床意义。

近年来，国内外学者研究发现一些中草药具有良好的抗金黄色葡萄球菌作用。胡芳等[5]用试管稀释法测定几种抗生素单用及与双黄连伍用对细菌的体外最低抑菌浓度(MIC），结果显示，双黄连粉针与青霉素、头孢唑啉及红霉素配伍后对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果明显增强。何显忠等[6]报道金银花能抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖、降低金黄色葡萄球菌感染小鼠的死亡率。本研究选用金荞麦、黄连、连翘、大青叶、菊花、金银花、蒲公英、板蓝根、鱼腥草、紫苏这10种常用中草药为试验材料，对临床分离的金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果进行研究。结果表明，黄连、大青叶和连翘的抑菌效果较好。由此提示，在临床用药中可选择这3种中草药作为首选药进行配伍组方来预防和辅助治疗鸡金黄色葡萄球菌病。

本试验仅做了中草药对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果，但药物进入动物体内后能否达到积极的抑菌效果，有待于进一步的动物试验加以验证。

[1]陈燕丽，茵栀黄注射液抗金黄色葡萄球菌作用及机理研究 [D].重庆：西南大学，2007.

[2]郎利敏，王克领，张立宪，等.10味中药对畜禽大肠杆菌的体外抗菌活性试验 [J].中兽医学杂志，2011，3：6-8.

[3]王德海，程国富 .10种中草药对金黄色葡萄球菌的体外抗菌试验 [J].动物医学进展，2005，26（6）：95-98.

[4]程国富，王德海，谷长勤，等.45种药物对鸡关节源性金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果 [J].动物医学进展，2004，25（6）：87-89.

[5]胡 芳，吕丽艳，刘伯阳 .双黄连粉针与几种抗生素伍用的体外最低抑菌浓度研究 [J].中国药业，2003，（2）：51.

[6]何显忠，兰荣德 .金银花的药理作用与临床应用 [J].时珍国医国药，2004，15（12）：865-867.