分子生物学技术在动物营养学中的研究现状与展望

王涛 （山东省胶南市张家楼镇青岛康大兔业发展有限公司繁育中心 266406)



分子生物学技术在动物营养学中的研究现状与展望

王涛 （山东省胶南市张家楼镇青岛康大兔业发展有限公司繁育中心 266406)

随着动物营养学的不断发展，动物营养学在现有的条件下在生产性能等方面的提升空间已近很小，所以急需一种新的技术来改变这一现状，来实现动物营养学的再次飞越。分子生物学的产生是动物营养学突破这一现状成为了可能。基因克隆、转基因技术、基因工程的出现将分子生物学技术在生物学的研究推向分子水平，分子生物学技术已成为研究和揭示生命现象本质和规律的一种重要工具。动物机体的生理病理变化，如生长发育、新陈代谢、遗传变异、免疫与疾病等，从本质来说，都是基因的表达、调控发生改变的结果。许多生命现象最终需要在分子水平上解释阐明。所以，动物营养学的研究应用与分子生物学技术，尤其是与基因工程技术相结合，使人们研究营养素对机体的作用机制、动物机体的生理病理变化等问题从机体水平上转移到分子水平上来，这是动物营养学今后的发展趋势之一。因此，及时全面地了解分子生物学理论和技术的发展对指导动物营养学的研究有特别重要的意义[1,3]。

1　营养与基因表达调控的关系

所谓基因表达是指按基因组中特定的结构基因上所携带的遗传信息，经转录、翻译等步骤指导合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质过程。随着分子生物学技术的不断发展，越来越多与代谢有关的动物基因被克隆和鉴定，人们对营养与基因调控的关系越来越感兴趣。营养与动物基因表达调控的研究已成为当今动物营养学研究的一个热点领域。AUSTIN等描述了营养与基因表达的关系是营养素摄入影响DNA复制和改变染色体结构，二者又共同调控基因表达，即调控基因转录、翻译，决定基因产物，从而维持细胞分化、适应与生长。研究表明,主要的营养物质如糖、脂肪酸、氨基酸以及一些微量元素对动物体内许多基因的表达都有影响[3]。

1.1 日粮碳水化合物对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表达的调控 运用现代分子生物学的手段和方法已能够确定日粮中的某些营养物质与基因的表达之间存在着密切的联系。目前研究较清楚的是日粮中糖含量对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因表达的调控。PEPCK是动物肝和肾中糖异生作用的关键酶。当动物进食含有大量糖类的饲料时，PEPCK的启动子就会关闭，肝中 PEPCK水平大幅度下降；反之，PEPCK的启动子就会处于打开状态，肝中PEPCK水平得到大幅度提高。可见，营养成分对PEPCK的调控主要通过与启动子作用而实现的[4]。研究发现，这种酶的启动子在基因转录的启动部位(500bp范围内)包含有多种调节因子的结合位点，它们在代谢信号对基因作用时有重要意义。PEPCK基因转录的调节取决于胰岛素和cAMP的相对水平，而这又与糖的摄取有关[4]。所以，当进食含大量糖类的饲料时，由于cAMP水平的急剧下降以及胰岛素水平的急剧上升，从而抑制PEPCK基因的表达，导致肝中PEPCK水平大幅度下降；而当禁食或饲喂高蛋白低糖的饲料时，则情况相反。

1.2营养对脂肪酸合成酶(FAS)基因表达的调控 FAS是脂肪酸合成的主要限制酶，存在于脂肪、肝脏等组织中，在动物体内起催化丙二酰CoA连续缩合成长链脂肪酸的反应，其活性高低直接控制着体内脂肪合成的强弱,从而影响整个机体中脂肪的含量[6]。有关营养与FAS基因的表达调控，HESKETS等报道，糖类能诱导FAS基因的转录，而脂肪则抑制这种诱导的表达。研究表明，当给禁食后的成年鼠饲喂高糖低脂肪的饲料时，FAS基因的表达增强，而且相应的mRNA含量的增加幅度与碳水化合物的摄入量成正比[6]。（1）糖类对FAS基因表达的影响：研究表明,葡萄糖对FAS基因的表达调控可以通过与胰岛素的协同作用而得到显著提高。加入葡萄糖和胰岛素的脂肪细胞培养组织中，FAS mRNA水平比对照组提高了28%，单独添加葡萄糖比对照组提高了7%，而单独添加胰岛素则没有效果。RHOADS等发现，3-O-甲基葡萄糖不能激发FAS基因的表达，而6-磷酸-2-脱氧葡萄糖在脂肪组织中有类似葡萄糖的作用，能激发FAS基因的表达，这说明葡萄糖必须通过中间代谢环节才能对FAS基因的表达调控起作用[7]。试验表明，在成年大鼠肝细胞培养物中6-磷酸-2-脱氧葡萄糖水平与FASmRNA含量呈正相关。因此，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖极有可能是参与FAS基因表达的重要中间代谢物[5]。（2）日粮脂肪酸对FAS基因表达的影响：大量研究表明，日粮脂肪酸对FAS基因表达具有抑制作用，特别是日粮多不饱和脂肪酸(PUFA)(n-3)系可以抑制肝脏中脂肪合成，降低脂肪酸以甘油三酯形式的沉积。Clarke等(1990)用饱和脂肪酸（软脂酸）、单不饱和脂肪酸（三油酸甘油酯，n-9）、双不饱和脂肪酸(红花油,n-6)和PUFA(鱼油n-3)喂大鼠。结果表明，日粮中PUFA降低了肝脏中FASmRNA75%~90%，饲喂红花油大鼠肝脏中的FASm RNA丰度是鱼油的2倍，说明n-3脂肪酸对FAS基因转录的抑制比n-6脂肪酸有效。而软脂酸甘油酯和三油酸甘油酯对FASmRNA无影响[8,13,14,20]。（3）蛋白质对FAS基因表达的影响：BONNET的研究结果表明,高蛋白饲粮抑制猪脂肪组织中FAS基因的表达,脂肪组织中FASmRNA的含量显著下降:用蛋白质含量分别为14%,18%,24%的日粮饲喂60~ 110kg的肥育猪,其脂肪组织中FAS mRNA的含量分别下降了8.14%，11.73%和48.20。由此可见，日粮蛋白质可以影响脂肪组织中FAS基因的表达，但具体的调控机理目前还不清楚。

1.3营养对瘦素(Leptin)基因表达的影响 Leptin是脂肪细胞分泌的一种调节体脂沉积的重要因子，是由146个氨基酸残基组成的非糖基化多肽。Leptin是由肥胖基因(ob基因)编码的，其表达具有组织特异性，表达部位主要在脂肪组织。动物试验和临床研究表明：重组人瘦素可用于肥胖症和Ⅱ型糖尿病的治疗；在动物遗传育种方面，利用瘦素有望提高家畜瘦肉率及繁殖性能。研究表明，禁食和长链脂肪酸可显著降低Leptin基因表达，重新进食后，又可恢复正常的表达；高脂肪食物可增加其表达和血浆leptin水平，肿瘤坏死因子α(TNF-α)可直接作用于脂肪细胞调节leptin的释放，胰岛素和皮质酮可增加啮齿类和人类脂肪细胞中Leptin水平，铬可显著降低瘦素水平，抑制Leptin基因的表达[10,18]。

1.4 其它营养素对基因表达的调控 有研究表明，日粮中Zn缺乏降低了Leptin基因的表达；日粮中Cu缺乏导致肝脏FAS基因转录速度加快；日粮添加Cr可以调节葡萄糖乳酸循环和生长激素有关基因的表达，达到增加奶产和提高胴体品质的目的；Fe通过控制mRNA的稳定性和翻译过程，调节转铁蛋白的水平。某些氨基酸、维生素等均可调控有关基因的表达。Met对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白as1基因的表达有影响[22]。维生素也会对基因的表达产生影响，如生物素对氨基酸转氨甲酰酶基因的表达有重要作用。脂溶性维生素主要是对在mRNA转录水平上进行调控[12]。

2　分子生物学技术在动物营养学中的应用

2.1 基因重组技术 基因重组技术是将基因重新组合，使其在受体细胞中复制和表达，是改良生物性状的有力手段。瘦肉率是动物营养学家和动物遗传学家最为关注的问题之一，也是肌肉品质最为重要的指标之一。肌生成抑制素是骨骼肌生长的负调控因子，主要在骨骼肌中表达。其活性的丧失会引起动物肌肉的过度发育。肌纤维直径变大或纤维数增加，表现为双肌性状。利用基因工程技术可以筛选肌生成抑制素的抗体或抑制剂，使其与肌生成抑制素结合，灭活其功能；或者筛选能与肌生成抑制素受体结合的物质，拮抗肌生成抑制素的功能；还可以用突变的基因与正常动物的基因进行同源重组，获得肌生成抑制素基因缺失动物，从而提高动物的瘦肉率[9]。

植酸酶作为一种单胃动物的饲料添加剂，其饲喂效果已在世界范围内得到广泛的确认，它能有效的将植酸结合的磷有效的释放从而提高机体对磷的利用率，减少磷在动物粪便中的排出量，降低了环境的污染。随着饲料工业的发展和分子生物学的兴起，植酸酶的分子生物学研究，已成为世界性的研究热点之一。目前的研究主要集中在2个方面：一是植酸酶难以大量生产及生产成本过高。通过基因工程技术，利用生物反应器可有望成百上千倍地提高其表达量，而且反刍动物本身瘤胃微生物能合成植酸酶，利用此技术可以寻找出合成植酸酶的方法，从而得到大量的植酸酶；二是天然植酸酶的一些酶学性质(耐温性、pH适性、催化活性等)与饲料加工业和养殖业的要求不一致。目前，已从嗜温微生物中发现多种高温植酸酶，利用基因工程技术在分子水平上对植酸酶基因进行改造，可以生产出既耐高温又具有高酶活性的植酸酶品种，从而提高其在饲料中使用的有效性[1,2,11,12]。

2.2 转基因技术 转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，它是生命科学中发展最快的分支之一。随着植酸酶的研究成为热点，转植酸酶基因猪的研究也成为人们关注的焦点，此研究直接达到了在不降低环境质量的前提下，对养殖业解决磷污染提供了新的技术[21]。

转植酸酶基因猪就是将小肠中非致病区的大肠杆菌植酸酶基因与老鼠腮腺、舌下腺、颌下腺中负责合成唾液蛋白质的一小部分基因连接起来，将这个基因转入受精的胚胎中，然后将胚胎移植到待孕母猪体内，产生具有携带植酸酶基因的仔猪。利用DNA分析技术检测后代中是否具有转入的植酸酶基因。由于引物具有高度的特异性，所以植酸酶主要在唾液腺中分泌。研究表明，用含有53%植酸磷的大豆作为唯一的磷源配制日粮，饲喂具有中等唾液植酸酶含量的转基因猪进行检测，结果转基因断奶仔猪、生长育肥猪磷的真消化率为87.9%、98.8%，而非转基因的仔猪、生长育肥猪的磷真消化率为45.8%、51.9%。差异极为显著(P<0.01)，且粪中磷的含量下降75%、56%[21]。

2.3 改变动物体内的代谢途径 应用生物学技术改变动物的代谢途径是指在动物体内导入新的代谢途径，采用外来基因，加工后用于动物的表达。如半胱氨酸是羊毛合成的限制性氨基酸，由于半胱氨酸在羊瘤胃内降解，饲料中添加半胱氨酸并不能提高其在血清中的水平。如果羊自身能合成半胱氨酸，将会提高羊毛产量。Ward等(1991)将大肠杆菌中编码丝氨酸转乙酰酶、乙酰丝氨酸硫氢化酶基因和MT启动子连接，并在3’端装上GH基因的序列，然后通过转基因技术将这一构件导入羊体内，得到的转基因羊胃上皮细胞能利用胃中的硫化氢合成半胱氨酸。应用生物技术调控代谢还可通过对动物肠道微生物进行改造，赋予细菌以新的代谢能力。目前，国外已在进行将白蚁中编码分解木质素的有关酶基因克隆并转移给瘤胃微生物的工作，将大幅度提高反刍动物对秸杆类饲料的利用效率[14,15]。

2.4基因芯片 DNA芯片或cDNA芯片，又称为基因芯片或微阵列，是一种基因探针。由于DNA芯片技术具有快速准确、多样性、微型化和自动化等传统营养学研究方法无法比拟的优点，其在营养学研究中潜在的应用前景十分广阔。（1）寻找营养相关新基因，获取新基因是DNA芯片技术最主要的应用之一。利用DNA芯片技术，从芯片制备、杂交到信号扫描分析整个过程，一般只需要一周左右的时间。而且DNA芯片技术可以进行生物信息处理，确定基因表达谱，被检测目标DNA密度高，便于大量筛选新基因，大大提高了发现新基因的效率。（2）营养相关基因功能研究。DNA芯片可迅速将肿瘤、糖尿病等众多疾病基因与营养素联系起来，缩短实验周期，大大加快这些基因功能的确定，从而为揭示这些疾病的分子机制提供可能[16]。(3)营养相关疾病诊断。DNA芯片可以快速地检测基因突变，从正常基因组中分离出DNA并与DNA芯片进行杂交，即可获得标准图谱，从病变组中分离出DNA并与DNA芯片进行杂交，即可获得病变图谱，通过对这2种图谱的比较、分析，就可以得到病变的DNA信息[17]。因此，利用DNA芯片技术监测动物中营养相关基因的差异表达，将会成为预防和治疗营养相关疾病的重要手段。

3 展望

综上所述，以基因工程为核心的分子生物学技术应用于动物营养学研究领域，具有很大的潜力，它不仅为动物营养学研究提供了一套全新的技术和方法，而且可以在基因水平上解决许多营养学问题，还可在基因水平上解决许多动物机体生理病理变化、营养素的代谢调节机制及其与机体的相互关系等问题。随着分子生物学的发展和不断完善，抗生素替代品的生产，动物新品种出现，生理活性物质的大量生产都将成为现实。无可置疑，以基因工程为主导的分子生物学技术将为畜牧业的发展开辟广阔的前景，具有重要的技术意义和经济意义。

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（2011–03–026）

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