牛乳乳清蛋白过敏性研究进展

李 慧，刘小翠

（大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009）

食物过敏是世界各地普遍存在的一个严重问题。近年来，食物过敏的发病率逐年增加，食物过敏这一食源性疾病已引起广大食品消费者、生产者和研究者普遍关注。Helm等[1]指出，有1%～2%的成年人和高达8%的婴儿都产生过食物过敏。据报道，有8类食物经常引起过敏反应，占总过敏案例90%以上，它们分别为蛋、牛奶、鱼类、甲壳类动物、花生、大豆、核果类食物及小麦[2]。研究表明，食物过敏轻者可引起皮肤、胃肠道过敏症状，重者可致哮喘发作、休克甚至死亡[3]。

牛奶是优质的营养食品，但同时也可能会产生过敏反应，其过敏原主要是牛奶蛋白质。牛奶中含有多种蛋白质，其中，乳清蛋白中的β-乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要成分，其次为α-乳白蛋白，此外，牛血清白蛋白也能够引起食物过敏[4-5]。牛奶过敏会影响蛋白质的正常消化吸收，严重影响婴幼儿的健康成长。

1 乳清蛋白的组成

乳清蛋白（Whey protein）是牛奶中的一种主要蛋白质，其含量仅次于酪蛋白，占牛奶中蛋白质含量的18%～20%。乳清蛋白包括β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）、α- 乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、血清白蛋白（BSA）、免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白、糖基肽及一些生长因子[6]。其中，β-Lg和α-La是乳清蛋白的主要成分。乳清蛋白中的组分基本为球状蛋白质，其组分的一级结构、部分二级结构和三级结构已经研究清楚。

2 乳清蛋白的过敏性

2.1 α-乳白蛋白与食物过敏

α-La在所有哺乳动物乳中均存在，在牛乳清蛋白中的含量为19.7%，在人乳中含量较高。牛乳中的α-La是由123个氨基酸残基组成的结构紧密的单体球蛋白。尽管牛的α-La与人乳中74%的氨基酸序列完全相同，6%的化学性质相同[7]，但是仍然被认为是牛奶中主要的过敏原[8]。α-La中的60-80，91-96片段通过二硫键连接形成环状。动物试验表明，这部分是最容易引起过敏的结构[9]。然而，用胰蛋白酶水解的α-La片段对19个过敏患者进行试验表明，60-80，91-96这2部分肽段对于人免疫球蛋白E（IgE）并不是最主要的过敏原[10]。未改性的α-La和大量肽段容易与IgE结合，说明其具有重要的抗原决定部位构象。但对59-94部位的肽段降解后发现，其与IgE结合的能力比未改性的片段更高，这是由于抗原决定部位在蛋白质改性的过程中暴露而引起的[7]。此外，与IgE结合的部位主要位于α-La的疏水区域（如99-108）和分子内部（如17-58 和 109-123）。其中，17-58，109-123 片段与人的α-La有非常相似的序列，分别占α-La的 81%和 87%[11]。

2.2 β-乳球蛋白与食物过敏

β-Lg是牛乳清中的主要蛋白质，其单体是由162个氨基酸残基折叠成的紧密球状结构，约占乳清蛋白的43.6%，人乳中不含有。有资料表明，β-Lg是牛奶中最容易引起过敏的蛋白质。Hattori等[12]研究表明，乳蛋白过敏的人中有82%的人对 β-Lg过敏。Selo等[13]指出，β-Lg分子上分布有许多抗原决定部位。其中，一些是直链的氨基酸序列，而另一些引起免疫反应的结构是非常大的片段，可能包括抗原决定簇的构象或部分抗原决定簇。β-Lg中最容易引起过敏的片段是41-60，102-124和149-162的氨基酸序列，90%以上的病人都会对这些片段产生过敏，它们占到乳球蛋白与IgE总反应的10%～15%。149-162的碳端肽段形成弯状结构，这部分主要包括一些短的α-螺旋结构，晶体结构很容易发生变化。而102-124及41-60的片段则在氢键和二硫键的作用下形成稳定的环状，分布在分子表面，很容易和抗体结合[14]。此外，还有一些肽段也容易引起过敏，但其过敏性比上述肽段低。1-8，25-40及92-100的肽段会使52%～65%的病人血清产生过敏；40%患者的血清对9-14，84-91的肽段产生过敏反应；72-83，125-135的肽段会引起少数人过敏。值得注意的是，氨基酸序列124-134是β-Lg亲水部位，位于分子表面且具有很强的免疫反应性[15]。Ball等[16]研究表明，84-91 的肽段并不在β-乳球蛋白分子的表面，但是仍有大约40%的人对其过敏。其他的2个肽段9-14及92-100没有暴露在分子表面，而且不容易被酶解，因此，它们的免疫活性较小[13]。用溴化氢将8-24的肽段降解，发现9-14序列与IgE结合的特异性显著降低，表明15-24是引起过敏的主要片段。用溴化氢将25-107的序列降解成小肽 25-40，41-60，78-83，84-91 和 91-100，发现66%的血清中并未降低其与IgE结合的能力。这表明在这段序列上至少有5个不同的抗原决定部位[7]。

3 乳清蛋白的改性

清除或降低乳中过敏原最有效的方法是将过敏原物质完全分离去除。将β-Lg去除后可以模拟人乳，并且这种方法可以用于生产婴儿配方牛奶，但是这种方法费用很大，实际生产中很难实施[17]。因此，目前主要通过蛋白质改性的方法来控制和消除乳清蛋白中的过敏原。蛋白质的改性方法主要是利用物理因素（如热、射线、机械振荡等）、化学因素（如化学试剂等）或酶制剂使蛋白质的空间结构破坏，多肽链及氨基酸残基发生某种变化。目前，常见的乳清蛋白改性方法主要有加热处理、糖基化反应、发酵及酶解等。

3.1 加热处理（Heat treatment）

加热处理主要是使蛋白质的构象发生变化，蛋白质的结构展开，二硫键断裂。对β-Lg加热改性的研究表明，改性后的β-Lg在前肠黏膜的反应加强，从而改变了β-Lg的免疫学性质[18]。Kleber等[19]通过90℃热处理β-Lg，证明了在热处理β-Lg变性聚胶同时，β-Lg的抗原决定簇的活性被明显掩盖，从而使β-Lg的致敏性明显降低，这种方法可以在一定程度上减少β-Lg的致敏性。但由于加热过程中蛋白质与乳糖形成复杂的结构，将会增加赖氨酸的损失，降低蛋白质的营养价值[20]，而且加热后使牛奶产生一定的蒸煮味，从而影响感观特性。同时，对牛乳进行加热处理也会使一些具有生物活性的免疫因子如免疫球蛋白等受到破坏。

3.2 糖基化改性（Glycosylation）

糖基化作用就是将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上的α或ε-氨基相连接而形成糖基化蛋白的化学反应。研究表明，通过糖基化改性的β-Lg，其过敏性有效降低，而且提高了其热稳定性和乳化特性。Makoto等[21]以葡聚糖、葡萄糖胺、壳戊糖和壳聚糖为糖基供体，通过美拉德反应对β-Lg的糖基化改性进行了研究，ELISA免疫试验发现，以壳聚糖和葡聚糖为糖基供体的糖基化反应能明显降低β-Lg的过敏性，而且糖基化的β-Lg乳化特性比原β-Lg有明显提高。Tomomi等[22]通过将β-Lg与壳聚糖（Chitosan）按1∶1或1∶2的比例结合，经过分析可以在一定程度上降低β-Lg的致敏性，并且基本上保留了β-Lg的生物活性，其中，第2种比例比第1种效果好。但Leonil等[23]研究发现，糖基化的β-Lg的46-61的肽段是抗原决定部位。而且糖基化改性会影响蛋白质的营养价值甚至安全性[24]。糖基化会破坏必需氨基酸，尤其是造成赖氨酸的较大损失，而且小肠对改性蛋白的消化吸收降低也造成营养价值损失。关于糖基化蛋白的许多毒理学资料是以体外试验为基础，而体外试验的资料与体内试验影响相关性研究不多，因此，糖基化蛋白的安全性还不能得到证实[25]。

3.3 发酵（Fermentation）

Jedrychowski等[26]研究表明，牛奶经乳酸菌发酵后乳清蛋白的过敏性比原来降低了99%，但β-Lg和α-La的过敏性并没有消除，只是减弱了。而且牛乳发酵后呈酸味，不宜加热，婴幼儿不容易接受。

3.4 酶解（Proteolysis）

蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低过敏反应的一种有效方法。蛋白酶通过水解乳清蛋白的抗原决定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳过敏反应。不同的蛋白酶具有不同的特异性，因此，随着所采用酶的不同及酶解条件的不同，酶解产物及抗原性的降低也有所不同。常用于乳清蛋白酶解的酶制剂主要有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，此外还有关于Corolase、阴离子蛋白酶等酶解乳清蛋白的报道。随着使用酶的种类不同，酶解位点、酶解率及酶解产物也有较大的差异。乳清蛋白由于具有二硫键，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起过敏的原因[27]。

Ena等[4]研究表明，用胃蛋白酶和Corolase PP结合水解能够彻底去除乳球蛋白和牛血清白蛋白的抗原决定部位，而用Corolase 7092酶解则几乎对其抗原部位没有影响。Penas等[28-30]通过酶水解与高压相结合处理乳清蛋白溶液，以降低β-Lg的致敏性，试验选用了4种酶（Alcalase，Neutrase，Corolase 7089 和 Corolase PN-L）并最终确定最佳结果的2种酶和相应条件（Corolase P N-L，40 ℃，15 min，300 MPa；Neutrase，50 ℃，15 min，300 MPa），通过 ELISA 检测，试验降低了β-Lg的大部分致敏性。Bonomi等[31]通过酶水解与高压结合处理乳清蛋白溶液，试验选用了菠萝蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰岛素和胰凝乳蛋白酶，最终确定胰岛素和胰凝乳蛋白酶有较高的抗压活性，可在合适的高压处理下同时使用（600 MPa，10 min，pH 值为 6.8，酶解温度为 30，37，44 ℃），对于β-Lg致敏性消除效果很好。对酶解产物分析发现，乳清蛋白的过敏性与酶解产物的分子质量有关。Van Berestijn等[32]研究表明，引起I型过敏反应片段的最小分子质量为3 000～5 000 Da。Ena等[4]报道指出，分子质量小于3 400 Da的肽段不会引发IgE介导的过敏反应。Van Hoeyveld等[33]指出，分子质量大于2 600 Da的肽段会引发皮肤的过敏反应，而小于1 400 Da的肽段则不会，体外试验中能与IgE结合的最小分子质量范围为970～1 400 Da。

4 结语与展望

乳清蛋白由于具有较高的营养价值及功能特性[34]，一直以来被广泛的应用于食品工业。但乳清蛋白又是一种常见的过敏原，为了建立低过敏的水解模式，需要了解乳清蛋白的结构与免疫反应的关系、引起过敏的抗原决定部位的特点及其与IgE结合的部位。通过蛋白质改性的方法可以控制和消除乳清蛋白的过敏性，而且蛋白质改性能够使其功能特性和营养价值也得到改善。

乳清蛋白的酶法改性是降低过敏反应最有效的方法，因此，酶水解将会是今后研究的重点。目前，针对乳清蛋白过敏患者，通过蛋白质改性的方法开发低过敏或无过敏的乳制品将会被更多的应用于商业生产中，具有广阔的前景。

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