三叶因子的研究进展

余果宇， 张 勇， 张 云 (中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机制重点实验室， 昆明6503;昆明医学院生物化学教研室;通讯作者，Tel:087 －59855，E-mail:zhangy@mail.kiz.ac.cn)

三叶因子的研究进展

余果宇1，2， 张 勇1， 张 云1*(1中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机制重点实验室， 昆明650223;2昆明医学院生物化学教研室;*通讯作者，Tel:0871 －5198515，E-mail:zhangy@mail.kiz.ac.cn)

三叶因子; 组织分布; 黏膜修复; 肿瘤

三叶因子(trefoil factor，TFFs)是一类含一个或几个三叶因子结构域的分泌蛋白，该结构域是一段38或39个氨基酸的多肽，其中的6个半胱氨基以1－5，2－4，3－6配对的构型方式生成三对二硫键，从而形成典型的三叶状结构，此结构赋予TFFs家族蛋白耐酸、耐碱和耐蛋白酶水解的性质，同时也是其行使功能所必需的。人TFFs包括含一个三叶因子结构域，与乳腺癌相关的多肽(TFF1或PS2)和小肠三叶因子(TFF3或ITF)以及含两个结构域的解痉挛多肽(SP或TFF2)。TFFs在黏膜防御、修复、再生等过程中发挥着重要作用，并且其表达的异常与疾病的发生发展密切相关。下面就TFFs的组织分布、黏膜修复功能以及与肿瘤的关系作一综述。

1 三叶因子的组织分布

胃肠道是TFFs的主要合成部位，TFF1主要表达在胃黏膜表面，TFF2主要分布在胃窦颈区，幽门黏膜区底部和十二指肠Brunner’s腺体中，即分布在从基底部到中间的位置，其分布正好和TFF1互补。TFF3主要表达在成熟杯状细胞中并被分泌到肠黏膜表面［1］。而在其他组织的黏膜上皮，如唾液腺、角膜、结膜、泪腺导管、喉部、子宫颈内膜、淋巴组织、下丘脑和垂体等也有TFFs的表达，其表达量的改变常相关于临床疾病的发生。

2 三叶因子的组织修复功能

胃肠道黏膜的正常修复依赖基底膜上皮细胞的迅速迁移，这需要黏膜分泌很多物质，而TFFs是最关键的。在胃黏膜受损时，TFFs以自分泌的方式持久性地迅速合成、分泌和分配。体外模型中，TFFs参与不同阶段的愈合过程，在调节细胞免疫、促进黏膜再生与修复、调节细胞间连接和促进细胞迁移等方面都发挥了重要作用，所以TFFs被称为腔内监督肽。

2.1 三叶因子在免疫反应中的作用 TFFs能促进炎症的发生，认为可能与免疫调节相关。表皮受损后，TFFs表达增加并且刺激细胞迁移以促进短期愈合和长期上皮再生，并通过增强黏液屏障来减少受损表皮的抗原反应。在TFFs基因敲除的老鼠中，TFF1缺陷者形成幽门腺瘤和癌，TFF3敲除者由于肠细胞的凋亡而增强其对损伤的敏感性;TFF2缺陷者表现出胃黏膜的增厚，黏液颈细胞数目、胃腺高度和胃黏膜增殖率降低［2］。在胃幽门和Brunner’s腺体中，TFF2的缺陷还能使TFF3的表达增加40倍，而对TFF1缺陷的老鼠，TFF2的敲除并不改变TFF3在胃中的表达，提示TFF2对TFF3表达的影响依赖于TFF1。TFFs表达在脾、胸腺、淋巴结和骨髓的事实也提示它们参与免疫反应，而TFFs被用来治疗溃疡性结肠炎、克罗恩病以及感染性肠病源于TFFs能引起单核细胞的迁移。TFF2也能减轻肠炎模型中的炎症和溃疡的发生。TFF3则通过NF-кB增强衰变加速因子基因启动子的活性和mRNA的稳定性以促进其表达，从而阻止肠上皮细胞补体的激活和沉积以减轻免疫反应。

2.2 三叶因子促进黏膜的再生与修复 黏膜受损时，通过增殖和分化完成再生的过程过于缓慢。因此，邻近细胞迁移到受伤部位建立紧密的黏膜屏障来阻止广泛感染的发生是上皮迅速修复所必需的。这一基础修复过程因无细胞增殖和蛋白质合成，所以几分钟内即可完成，但黏膜需要能量依赖性地持续血供，而糖酵解就为这种早期的细胞迁移过程提供能量，同时也为细胞的极化和紧密连接的形成，即形态的修复提供能量。而黏膜屏障的完全恢复则依赖于线粒体的有氧氧化［3］。在胃肠道受损时，TFF2的表达迅速升高，它通过抑制胃酸的分泌和刺激黏膜细胞增殖来发挥促黏膜修复功能，并通过与特异性受体的结合来调节此功能［2］。TFF3能激活HT-29中表皮生长因子受体(EGFR)并磷酸化β连环蛋白，而在另一些细胞系中，TFF3则依赖EGFR反式激活和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的方式阻止细胞凋亡［4］。

2.3 三叶因子调节细胞间连接 TFFs能降低细胞间以及细胞与基质的相互作用以增强细胞间的分散。TFF1和TFF3的过表达诱导细胞在胶原中分散性地生长，TFF2也诱导细胞由致密型生长方式转变为分散型。事实上，TFFs通过降低E－钙黏素、α－连环蛋白和β－连环蛋白的表达来调节细胞的黏着连接，从而增强细胞间的分散度。TFFs作用的另一个结果是蛋白激酶的磷酸化。由TFF3引起的β－连环蛋白的磷酸化是E－钙黏素/连环蛋白复合物的酪氨酸发生磷酸化的基础。

2.4 三叶因子促进细胞迁移 细胞发生迁移需要破坏细胞间以及细胞与基质之间的连接，而这种连接的丧失会引发细胞凋亡。TFFs在没有促进细胞增殖、肿瘤形成或破坏其相互作用的情况下，成为维持上皮再生所必需的唯一一类蛋白家族，但其作用机制目前仍不清楚。TFF1和TFF2表达在腺上皮的柱状细胞中，以自分泌的方式发挥作用;TFF3表达在杯状细胞，以一种旁分泌的方式作用于邻近肠细胞。体外受损模型中，TFF2和TFF3能引起受损上皮细胞以3－6倍的速率迁移到受损区域，而对正常肠细胞则无促细胞迁移活性。

3 三叶因子与肿瘤的发生

TFFs是促进还是抑制肿瘤的形成，迄今为止仍有很多争议。但TFFs的异常表达出现在多种实体瘤中，TFFs是分泌性蛋白，所以用免疫组化，或者定量分析组织或细胞中的蛋白含量都不能用来作为预测患者病理程度或评判其预后的最佳指标。相反，分泌型TFFs出现在外周循环中，所以血清中TFFs的水平能够为那些依赖TFFs的肿瘤提供更有效的评判信息。

3.1 作为肿瘤抑制因子 胃黏膜的慢性感染是胃癌发生的基础。受损胃黏膜中，TFF2和TFF3持续上调，TFF1则下调，这一现象早于组织化生形成前。胃癌中，TFF1表达丧失并伴随等位基因的缺失，说明TFF1是一种肿瘤抑制基因，它表达的缺失源于启动子的超甲基化。在转化或非转化胃肠道细胞系中过表达或引入外源性TFF1二聚体都会通过延迟G1期向S期的转化来减弱细胞的增殖以减少细胞数目［5，6］。尽管一种异常的 TFF2 表达谱系(SPEM)是早期胃癌发生的明显标志，但TFF2的突变在胃癌中还是很少见，仅在第二个内含子中出现一个重复序列多态性，并且这种突变与胃癌的发生没有明显的相关性。在胃癌发生的整个过程，幽门螺旋杆菌的感染使TFF2启动子的甲基化水平升高，而后者又可降低TFF2 mRNA及蛋白的表达水平;基因组的去甲基化则可恢复TFF2在胃癌细胞系中的表达。事实上，TFF2的表达能够抑制胃组织的癌前病变和胃癌的进展，TFF2的缺陷则减弱胃黏膜细胞的增殖，从而降低胃黏膜的厚度、胃腔的面积和腺体的高度，但TFF2表达的改变与肠癌细胞系的增殖无关。在肠腺瘤到癌的转变过程中，TFF3的mRNA和蛋白水平都明显下降，并且肠癌细胞系增殖能力的减弱相关于TFF3的过表达，TFF3也可以适度减弱裸鼠体内肿瘤的种植性生长［2，7］。

3.2 作为肿瘤促进因子 TFFs通过促进细胞增殖，保护细胞免受凋亡，刺激细胞迁移浸润和血管生成等来促进肿瘤的形成和转移，所以TFFs是癌症发生发展过程中的关键调节子。

3.2.1 增殖 细胞增殖是肿瘤发生的决定性因素。TFF1能增加细胞周期蛋白D1在细胞内的含量，从而加速细胞的增殖以促进肿瘤的形成［5］。在肠癌和乳腺癌细胞系中，TFF2通过促进细胞周期的进程来使细胞增殖，而重组TFF2在浓度大于10 mg/ml时也具有明显的促胃腺癌MKN-28细胞增殖的效应［8］。但也有研究表明，与TGF-α和β不同，TFF2和TFF3通过促进细胞迁移来帮助伤口愈合，而不是通过调节上皮细胞的增殖发挥作用。TFF3的自分泌性表达也可以增强乳腺癌细胞系的增殖，而反义分子消除TFF3的表达后又可以减弱胃癌细胞系的倍增时间［9］。

3.2.2 凋亡 凋亡过程的抑制也是肿瘤发生的关键步骤。TFFs通过抑制细胞迁移过程中的凋亡来促进肿瘤的发生和转移。在修复过程中，TFFs的促动力效应与它们的抗凋亡功能相一致。TFF1通过降低细胞凋亡蛋白酶(caspase)的活性来保护胃癌和肠癌细胞免受化学、不能贴壁或者细胞死亡引起的凋亡，从而增强它们的存活率［5］，同时TFF1也能保护胃癌细胞免受拓扑异构酶抑制剂依托泊苷引起的凋亡［9］。TFF2的过表达能对抗胃癌细胞的凋亡并且与抑癌基因P53密切相关，P53通过作用激活蛋白1(AP-1)相似位点下调TFF2的表达，从而引发细胞凋亡和抑制细胞迁移，提示TFF2可能是P53下游的重要目的蛋白［10］。同样TFF2也能抑制无TFF2表达的乳腺癌细胞系MCF-7的凋亡，而对那些表达TFF2的细胞系则无这种细胞保护效应。TFF3的凋亡效应依赖于其完整的二聚体形式，并且通过激活EGFR和PI3K通路来磷酸化Akt以发挥效应。也有研究认为TFF3通过PI3K/Akt/核因子κB(NF-κB)来抑制与锚定蛋白相关的凋亡，激活的NF-κB同时调节NOS-2和环氧化酶2(COX-2)基因的表达以调节细胞的凋亡［11］。在肠癌细胞系中，自分泌的TFF3以依赖PI3K的方式对抗无血清和C2神经酰胺引发的凋亡，同时通过激活Akt蛋白激酶B的方式来增强乳腺癌细胞系的存活。

3.2.3 迁移和浸润 细胞迁移和浸润是肿瘤转移的关键。在正常和肿瘤细胞中，TFFs都具有潜在的促细胞运动功能，而且这一活性常依赖于ERK1/2磷酸化的增强以及PKC的激活。自分泌的TFF1足以引起肠癌细胞发生持续性地浸润，同时也是乳腺癌细胞的潜在化学趋化物。TFF1通过PI3K依赖的方式促进胃癌细胞迁移和浸润［6］。TFF2在正常和恶性乳腺上皮细胞中都有表达，这种表达与雌激素受体的存在与否无关，并且TFF2能促进乳腺癌细胞的迁移。在浸润型胃肿瘤细胞，弥漫型或有淋巴结和血道转移的胃癌组织中TFF2都是高表达。表达TFF2的肿瘤患者的预后也较不表达者为差，提示TFF2在胃癌的浸润中发挥了重要功能，并可能作为一种有用的目的蛋白来干预治疗［12］。TFF3也能通过调节E－钙黏着蛋白—连环蛋白复合物的功能促进肠癌细胞的迁移和浸润［13］。

3.2.4 血管生成 新生血管的生成是肿瘤发生、发展和转移所必需的条件。无论在体内还是体外，TFFs都作为血管生成因子促进血管生成。TFF1诱导的血管生成反应既依赖于COX-2，又依赖于EGFR。而TFF3是通过诱导一氧化氮(NO)合成酶来刺激NO的生成，而NO是肿瘤血管生成的一种重要内皮生成因子，胃癌发生中肿瘤血管的生成也与TFF3表达的增强相伴而行［14］。

总之，TFFs是一类分布广泛，在生物体内具有重要生物学功能的调节因子，它们的生理病理功能与组织再生修复、细胞迁移、增殖分化乃至肿瘤的发生发展等功能密切相关，这也使其可能作为炎症发生的调节子、抑癌基因或癌基因来参与肿瘤的发生和发展。所以不容置疑的是，随着对TFFs生物学功能研究的深入，将使它们在医学领域得到越来越广泛的运用。

［1］ Madsen J，Nielsen O，Tornoe I，et al.Tissue localization of human trefoil factors 1，2，and 3［J］.J Histochem Cytochem，2007，55(5):505－513.

［2］ Farrell JJ，Taupin D，Koh TJ，et al.TFF2/SP-deficient mice show decreased gastric proliferation，increased acid secretion，and increased susceptibility to NSAID injury［J］.J Clin Invest，2002，109(2):193－204.

［3］ Cheng AM，Morrison SW，Yang DX，et al.Energy dependence of restitution in the gastric mucosa［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2001，281(2):C430 －438.

［4］ Taupin DR，Kinoshita K，Podolsky DK.Intestinal trefoil factor confers colonic epithelial resistance to apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(2):799 －804.

［5］ Bossenmeyer-Pourie C，Kannan R，Ribieras S，et al.The trefoil factor 1 participates in gastrointestinal cell differentiation by delaying G1-S phase transition and reducing apoptosis［J］.J Cell Biol，2002，157(5):761 －770.

［6］ Yio X，Diamond M，Zhang JY，et al.Trefoil factor family-1 mutations enhance gastric cancer cell invasion through distinct signaling pathways［J］.Gastroenterology，2006，130(6):1696 － 1706.

［7］ Peterson AJ，Menheniott TR，O’Connor L，et al.H.pylori infection promotes methylates and silences TFF2 leading to gastric tumor development in mice and humans［J］.Gastroenterology，2010，139(6):2005 －2017.

［8］ Sun Y，Wu W，Wang L，et al.Overexpression of hTFF2 in the pET system and its in vitro pharmacological characterization［J］.Biomed Pharmacother，2010，64(5):343 －347.

［9］ Chan MW，Chan VY，Leung WK，et al.Anti-sense trefoil factor family-3(intestinal trefoil factor)inhibits cell growth and induces chemosensitivity to adriamycin in human gastric cancer cells［J］.Life Sci，2005，76(22):2581 － 2592.

［10］ Tu SP，Chi AL，Ai W，et al.p53 inhibition of AP1-dependent TFF2 expression induces apoptosis and inhibits cell migration in gastric cancer cells［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2009，297(2):G385 －396.

［11］ Cristina Cerquetti M，Hovsepian E，Sarnacki SH，et al.Salmonella enterica serovar Enteritidis dam mutant induces low NOS-2 and COX-2 expression in macrophages via attenuation of MAPK and NF-kappaB pathways［J］.Microbes Infect，2008，10(14 － 15):1431－1439.

［12］ Dhar DK，Wang TC，Maruyama R，et al.Expression of cytoplasmic TFF2 is a marker of tumor metastasis and negative prognostic factor in gastric cancer［J］.Lab Invest，2003，83(9):1343 －1352.

［13］ Rivat C，Rodrigues S，Bruyneel E，et al.Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3(TFF3)-and vascular endothelial growth factor-mediated cellular invasion and tumor growth［J］.Cancer Res，2005，65(1):195－202.

［14］ Dhar DK，Wang TC，Tabara H，et al.Expression of trefoil factor family members correlates with patient prognosis and neoangiogenesis［J］.Clin Cancer Res，2005，11(18):6472 － 6478.

R329.2

A

1007 －6611(2011)01 －0087 －04

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.024

973项目(2010CB529805);国家基金委重点项目(30630014);国家基金委面上项目(30570359);中国科学院重要方向项目(KSCX2-YW-R-088)

余果宇，女，1972－05生，博士，副教授，E-mail:yuguoyu725@163.com.

2010－11－04］