胎盘Hofbauer细胞介导的HBV与HBIG阻断的相关性

孙丽娟 孙 淑媛 朱 宝申 尹华春

我国是乙型肝炎(HBV)高发区，随着乙肝疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白的应用，乙型肝炎的母婴传播已明显减少，但HBV宫腔内感染仍是乙型肝炎母婴阻断工作中的难题，孕妇血清中HBV病毒达到一定量时可使胎盘组织受染，继而引起宫腔内感染。胎盘Hofbauer细胞是存在于胎盘中的免疫细胞，具有游走和抗原提呈的特性，可对外来抗原(细菌和病毒等)进行吞噬、加工和提呈［1］。目前文献报道垂直传播组胎盘Hofbauer细胞总数及结合HBV的Hofbauer细胞数明显高于非垂直传播组。而在未感染HBV母亲的胎盘中，Hofbauer细胞非常少，提示Hofbauer细胞在HBV经胎盘母婴垂直传播中具有重要作用。孕期是否注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)进行阻断一直以来是个存在争议的话题，我们经过长期的临床观察及对比研究，发现孕期注射乙肝免疫球蛋白可中和部分乙肝病毒，但对母婴阻断不能起到决定性作用，甚至会导致乙肝病毒变异从而增加宫内感染的几率。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选 择2008至2010年在河北省石家庄市第五人民医院分娩的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性孕妇及其所生新生儿100例为研究对象，其中50例孕妇于孕28、32、36、39周分别肌内注射乙肝免疫球蛋白(成都蓉生制药生产)200/400 U，(HBsAg、HBeAg双阳性孕妇和/或 H BV-DNA ＞500 U/ml每次注射400 U，HBsAg阳性且HBV-DNA＜500 U/ml孕妇每次注射200 U)，行产前母婴阻断。50例产前未给予任何治疗。另外选择同期该院住院分娩的HBsAg阴性，且HBVDNA＜500 U/ml孕妇20例作为对照。孕妇平均年龄27岁;孕周37～42周，新生儿平均体重(3 250±859)g，其中男婴56例，女婴64例，无畸形儿。排除慢性乙型肝炎肝功能中度以上异常，妊娠期高血压综合征，孕期或产前6个月给予抗病毒药物等干扰因素，经实验室检查包括垂直传播组［母婴血HBsAg和(或)HBV-DNA均为阳性］;非垂直传播组［母亲血HBsAg和(或)HBV-DNA均为阳性;新生儿外周血HBsAg和HBV-DNA均为阴性］。均排除疱疹病毒、梅毒、丙型肝炎、弓形体、艾滋病(HIV)及其他病毒感染。

1.2 方法 血 清检测:采集孕妇肘静脉血3 ml，胎儿娩出6 h内股静脉血2 ml，1 500转/min离心分离血清，20℃保存备用。新生儿采血后6 h内常规注射HBIG和乙肝疫苗。测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA，厦门英科新创科技公司)测定孕妇及新生儿外周血清 HBsAg，采用PCR技术测定孕妇及新生儿外周血清HBV-DNA(中山医科大学达安基因股份有限公司)结果检测全在自动酶联检测仪 (MultiskanMK 3)上进行。检测步骤:胎盘娩出后5 min内，取胎盘组织中央、边缘、中央与边缘1/2处各1 cm3，用10%戊二醛进行固定，然后冲洗、脱水、渗透包埋、切片制作。免疫组织化学细胞周围棕黄色为阳性染色，每张切片选择5～6个高倍视野，计数不少于500个细胞，取均数并评分:不着色为0分，着色淡为1分，着色深为2分;着色细胞占计数细胞百分率:≤5%为0分，6% ～20%为1分，21%～49%为2分，≥50%为3分，染色程度与染色细胞百分率得分乘积为最后得分。宫内感染阳性标准:新生儿出生6 h内未接受主被动联合免疫前静脉血 HBsAg和/或HBV-DNA阳性。0～1分为阴性病例，2分以上为阳性病例。

1.3 统计学分析 应用 SAS 10.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎儿宫内感染 检出率为8.0%(8/100)，其中垂直传播(母亲及新生儿HBsAg均为阳性)8例，其中新生儿HBV-DNA阳性2例。8例宫内感染新生儿中产前注射乙肝免疫球蛋白及未注射乙肝免疫球蛋白的各4例，2例HBV-DNA阳性新生儿为产前阻断新生儿。非垂直传播 (母亲HBsAg阳性，新生儿HBsAg阴性)92例。对照组无1例检出。

2.2 胎盘HBsAg的免疫组织化学 胎盘组织中的 HBsAg呈现棕黄色信号，垂直传播8例全部胎盘均检测出棕黄色信号，阳性率为100.0%;非垂直传播92例胎盘检测出 HBsAg阳性41例，阳性率为44.6%，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 HE染色 光学显微镜下垂直传播组和非垂直传播组孕妇的胎盘病理学改变基本相同，均有大量淋巴细胞、多形核白细胞、颗粒细胞浸润，及组织坏死水肿;绒毛及绒毛间质的病理改变中有绒毛水肿，干绒毛动脉硬化，绒毛间质纤维化和纤维素样沉积。对照组孕妇的胎盘间质较致密，结构完整，绒毛分支细而密，极少有水肿和坏死。于垂直传播组的胎盘Hofbauer细胞中可见圆形或卵圆形成熟病毒颗粒，形状不规则，大而饱满，由双层膜样结构包绕密度较高的同心圆颗粒样核心抗原组成。而在非垂直传播组，Hofbauer细胞中偶可见到病毒颗粒，但极少见到大而饱满的成熟病毒颗粒。

3 讨论

HBV宫内感染的母婴阻断一直以来是母婴阻断工作中的难题，是导致母婴垂直传播的主要途径。本研究通过比较对照组、垂直传播组和非垂直传播组胎盘组织结构、胎盘HBV感染及其与 Hofbauer细胞的关系，发现垂直传播组受到 HBV感染的胎盘结构被破坏。HBV主要感染胎盘滋养细胞、Hofbauer细胞和血管内皮细胞。已有资料表明，某些病原体如人类获得性免疫缺陷病毒(HIV 1)感染胎盘后，可在一定程度上激发细胞免疫反应，滋养层细胞可释放趋化因子，诱导胎盘血管中的免疫细胞游离出血管进入胎盘组织，参与炎性反应［2，3］。单核细胞是许多病毒隐匿和复制的场所。Hofbauer细胞也属于单核细胞系统，因而也可能成为HBV在胎盘中隐匿和复制的场所［4］。研究发现，病毒感染胎盘后多聚集在绒毛间质的 Hofbauer细胞内或其周围;Hofbauer细胞获取病毒后不能完全杀死病毒，反而成为了病毒寄生、复制的场所，并进一步成为传播的媒介［5］。研究发现HBV感染孕妇76%的胎盘受到 HBV感染，病毒多聚集在绒毛间质的 Hofbauer细胞内或其周围，提示Hofbauer细胞能富集胎盘靠近母体面的病毒［6－8］。正常情况下Hofbauer细胞可捕获并杀灭HBV病毒，但HBV病毒感染可使Hofbauer细胞杀灭病毒能力减弱，反而成为病毒传播的载体，及复制场所，导致宫内感染。本研究在 Hofbauer细胞周围及其细胞内找到了各种病毒样颗粒(管状病毒包涵体、空心病毒抗原颗粒或成熟的病毒颗粒)，提示Hofbauer细胞在可能是导致HBV母婴垂直传播的罪魁祸首。空心的病毒抗原颗粒为尚未组装的抗原，而管状病毒样颗粒为病毒芽生的特殊时期，成熟的病毒颗粒(Dane)具有高度传染性，这些反映病毒可在Hofbauer细胞内增生复制。本次研究发现8例宫内感染新生儿中产前注射HBIG及未注射乙肝免疫球蛋白的各4例，2例HBV-DNA阳性新生儿为产前阻断新生儿。由此可推测孕期注射HBIG后，可能会导致部分个体HBV病毒体在一定程度S区变异，变异的HBV感染胎盘后，感染其中的免疫细胞(Hofbauer细胞)，使免疫功能受损，甚至宿主免疫耐受，病毒不宜被识别，从而不能被完全杀死，胎盘的Hofbauer细胞可游走于胎盘母体与胎儿之间，而大量的Hofbauer细胞位于绒毛毛细血管周围，并随着细胞进入胎儿血液循环致使胎儿宫内感染。胎儿和新生儿免疫细胞尚未发育成熟，当其受HBV抗原物质，尤其是小分子量HBeAg直接刺激和诱导时，Th细胞可发生免疫耐受，导致被感染胎儿或新生儿的CTL杀伤力降低，B细胞分泌特异性抗体减少，不能产生足够的免疫应答，导致免疫耐受［9］，虽然HBIG和基因重组乙肝疫苗的免疫效果得到了充分肯定，但由于HBV变异及宿主免疫耐受等因素，接种乙肝疫苗仍可能失败［10］，从而导致母婴垂直传播的阻断失败。本研究首次对孕期注射HBIG后感染HBV病毒的 Hofbauer细胞进行了超微结构变化观察，发现在 HBV垂直感染组中，胎盘 HBV感染可使Hofbauer细胞胞浆内线粒体肿胀，胞浆突起减少，胞浆内线粒体峭减少，粗面内质网及高尔基体萎缩，说明细胞转运水、电解质及吞噬功能减弱;胞浆内溶酶体减少，溶解和消化病原体的能力减弱，这将削弱胎儿在宫内受到免疫保护的能力。HBIG能中和体内表面抗原，并将病毒清除，但是此种蛋白不能进入肝脏，特别是肝细胞内，因此，HBIG必须在乙型肝炎病毒进入肝细胞前应用才能有效。故认为孕期注射乙型肝炎免疫球蛋白能减少体内病毒数量的说法并不可靠。但HBIG有被动免疫功能，孕期注射HBIG，抗HBs可通过胎盘到达胎儿体内，使胎儿在宫内获得被动保护而减少HBV感染几率［11］。但当孕妇体内乙肝病毒HBVDNA浓度达到108U/ml以上时，即使孕妇从28周后多次注射HBIG等，仍有43%的婴儿发生宫内传播。有研究分析比较了全程接种后的婴儿和母体内相关的基因序列，发现有碱基突变现象，而且比较普遍，主要是在免疫的压力下产生的。这个基因突变使疫苗的免疫功能下降，从而使机体的抗体水平下降，导致了宫内传播阻断失败［12］。这次研究中2例HBV-DNA阳性新生儿的母亲血液HBV-DNA均在107～108U/ml，故考虑胎儿宫内感染的原因可能与HBV病毒变异有关。

综上所述，对于HBV-DNA定量较高的孕妇不建议孕期注射乙型肝炎免疫球蛋白，防止人为干预诱导病毒发生基因突变，导致宫内感染。应采取其他阻断方案，例如孕晚期服用抗病毒药物等，通过减少体内病毒数量，从而减少宫内感染机率，增加母婴阻断成功率。

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