当归多糖磁性超滤膜分级分离

谢慧明，朱莹莹，张仕发，伍志刚

(合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

当归多糖磁性超滤膜分级分离

谢慧明，朱莹莹*，张仕发，伍志刚

(合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

基膜为80000的聚砜超滤膜经原位生成法制备得磁性超滤膜。在压力为0.2MPa条件下改变磁场强度，其截留相对分子质量可调控范围为31000～73000。利用此膜对纯度为97.5%的当归多糖进行连续分级分离，在不同磁场强度下得到3个样品(A、B和C)。高效凝胶色谱法测定样品A、B以及C的重均相对分子质量分别为86317、19989、62461，样品A中相对分子质量为70000～100000的当归多糖占70%左右；样品B中相对分子质量为10000～30000的当归多糖占95%左右；样品C中相对分子质量为50000～70000的当归多糖占80%左右。

当归多糖；磁性超滤膜；高效凝胶液相色谱；连续分离

当归多糖具有很强的生物活性，现代药理学研究证明当归多糖可以提高免疫力[1]、去除自由基[2]、激活补体活性等功效[3]、还具有镇痛[4]、保护胃肠黏膜[5]的作用，另外对抗肿瘤[6]、抗辐射损伤[7]也均呈现较好疗效。当归多糖的相对分子质量分布广泛，其生物活性与其相对分子质量范围密切相关的，多糖相对分子质量太大或太小均会影响其活性，其中抗补体活性高，免疫活性强的当归多糖其相对分子质量多在10000～30000之间[8-10]，能保护细胞，促进细胞增殖反应的当归多糖其相对分子质量多在50000～70000之间[11-12]，而具有抑制肿瘤作用的当归多糖相对分子质量一般在70000以上[13-14]。目前按相对分子质量分离当归多糖的方法主要有超滤法和凝胶柱层析法，其中超滤法[15-16]采用的均是截留相对分子质量不变的膜，不能实现当归多糖的连续分级分离。本实验拟采用实验室自制的磁性超滤膜，通过改变磁场强度，实现相对分子质量在10000～100000之间的当归多糖的连续分级分离。根据不同相对分子质量多糖具有不同的侧重功效，目标多糖分为3段不同相对分子质量范围：10000～30000、50000～70000、70000～100000。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

当归产于甘肃岷县；葡萄糖(AR) 国药集团化学试剂有限公司；苯酚(重蒸馏；AR)、无水乙醇(AR) 上海中试化工总公司；聚砜超滤膜 安得膜分离技术工程有限公司；右旋糖酐对照品(Mw分别为200000、133800、84400、41100、21400、7100、4600) 中国药品生物制品鉴定所；FeCl2·4H2O(AR) 天津太茂化学试剂厂；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

分析天平 美国西特公司；多功能膜分离设备 自制；UV-1600紫外分光光度计 北京奥生源科技有限责任公司；1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；Shodex OHPak SB-804HQ凝胶色谱柱 上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 当归多糖的制备

提取工艺：①当归粉碎，3倍量(mL/g)乙醇浸泡24h，收集滤渣，烘干备用；②水法浸提当归多糖工艺条件：料液比1∶10(g/mL)，浸提温度90℃，浸提时间3h，浸提2次；③过滤，离心，收集滤液减压浓缩，浓缩液经无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，得当归多糖粗提物备用。

超滤纯化：当归多糖粗提物溶于水中配成溶液，选择截留相对分子质量为10000的聚砜超滤膜对其进行超滤分离，得到的截留液再用截留相对分子质量为100000的聚砜超滤膜进行超滤分离，收集透过液，得到相对分子质量在10000～100000当归多糖溶液，冻干备用。

1.3.2 磁性超滤膜的制备与检测

图1 Fe3O4-PSF磁性复合超滤膜制备示意图Fig.1 Schematic diagram of the device for the preparation of Fe3O4-PSF magnetic ultrafiltration membrane

原位生成法制备磁性复合膜[17]：分别选用截留相对分子质量为70000、80000、90000的聚砜超滤膜作为磁性超滤膜的基体膜，无水乙醇浸泡基体膜10min后，将其置于超滤膜制备反应器中，如图1所示。反应器两侧加入的溶液分别为2mol/L NaOH溶液和0.2mol/L FeCl2乙醇溶液，反应45min后将复合膜取出，洗涤、晾干，分别记为膜1、2、3，保存备用。

截留相对分子质量的检测：采用葡聚糖检测其截留相对分子质量。由于压力过小，自制的磁性超滤膜通量小，过滤的速度比较慢；而压力过大，自制的磁性超滤膜会存在破裂现象，因此选择工作压力0.2MPa。实验装置示意图见图2，分别将不同相对分子质量的葡聚糖加入料液瓶中，在磁场强度0T、压力0.2MPa条件下，待流量稳定后收集一定量的截留液和透过液，紫外分光光度计检测其浓度，计算截留率R，规定R≥90%的截留基准物相对分子质量为膜的截留相对分子质量。

式中：R为截留率/%；C透为透过液浓度/(mol/L)；C原为原料液浓度/(mol/L)。

图2 磁场超滤装置示意图Fig.2 Schematic diagram of magnetic ultrafiltration device

1.3.3 磁性超滤膜截留相对分子质量可调控范围的测定

在0.2MPa条件下，0.2～1.0T间调节磁场强度，以葡聚糖为基准物，测出不同磁场强度下对不同相对分子质量葡聚糖的截留率，得出磁性超滤膜截留相对分子质量的可调控范围。

1.3.4 当归多糖分级分离

根据3张磁性超滤膜截留相对分子质量的调控范围，选取最合适分离目标当归多糖的膜，调节适宜的磁场强度，收集透过液或截留液，冻干称量，高效凝胶液相色谱分析其相对分子质量范围。

1.3.5 相对分子质量的测定

色谱条件：参照文献[18]的方法。色谱柱：Shodx OHPaK SB-804HQ；流动相 0.71%硫酸钠溶液(内含0.02%叠氮化钠)；柱温35℃；流速为0.5mL/min；示差折光检测器。

对照品溶液：精确称取右旋糖酐对照品，流动相配成3mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤。

供试品溶液：精确称取超滤后冻干的当归多糖，流动相配成3mg/mL的溶液，用0.45μm的微孔滤膜过滤。

标准曲线的制备：取重均分子质量为200000、84400、41100、21400、10000、4600D的右旋糖苷对照品溶液分别进样测定，记录峰值保留时间，GPC软件绘制标准曲线。

样品相对分子质量的测定：取供试品溶液进样测定，记录色谱图，根据峰值保留时间，GPC软件计算样品的重均相对分子质量和数均相对分子质量以及相对分子质量分布宽度。

2 结果与分析

2.1 当归多糖的制备结果

称取当归多糖粗提物50g，配成10g/L的溶液，选择截留相对分子质量为10000的聚砜超滤膜进行超滤分离，得到的截留液再用截留相对分子质量为100000的聚砜超滤膜进行超滤分离，收集透过液，得到相对分子质量在10000～100000当归多糖溶液，冻干得当归多糖10.22g，苯酚-H2SO4法测得其纯度为97.5%。

2.2 磁性超滤膜的检测结果

2.2.1 膜截留相对分子质量的测定结果

图3 无外加磁场下膜截留相对分子质量的测定Fig.3 Determination of MWCO of the prepared magnetic composite membrane without additional magnetic field

由图3可知，膜1、2、3截留率(R)为90%对应的基准物相对分子质量分别为65000、73000、83000。表明在超滤压力0.2MPa、无外加磁场的条件下，用截留相对分子质量为70000、80000、90000的基体膜制备的磁性复合超滤的截留相对分子质量分别为65000、73000、83000。磁性膜的截留相对分子质量相对基膜减小，是由于采用原位生成法制备磁性膜时，生成的纳米Fe3O4粒子绝大多数沉积在膜孔道中，致使膜孔变小，膜截留相对分子质量降低。

2.2.2 磁性超滤膜截留相对分子质量可调控范围的测定

由图4可知，0.2MPa条件下，在0.2～1.0T的范围内改变磁场强度，磁性超滤膜1～3的截留相对分子质量调控范围分别为25000～51000、31000～63000、42000～ 74000。其中不同磁场强度下，膜的截留相对分子质量如表1所示。

图4 磁性超滤膜截留相对分子质量可调控范围的测定Fig.4 Determination of MWCO range of the prepared magnetic composite membrane

表1 磁性超滤膜截留相对分子质量可调控范围的测定Table 1 MWCO range of the prepared magnetic composite membrane under different magnetic field intensities

根据上述测定结果以及目标多糖的3段不同相对分子质量范围：10000～30000、50000～70000、70000～100000，选用膜2进行以后实验较为适宜。

2.3 当归多糖分级分离结果

2.3.1 超滤分级分离

称取冻干后的当归多糖10.0g，配成5g/L的溶液，加入到料液瓶中，在0T、0.2MPa条件下收集截留液得样品A；再将透过液加入料液瓶中，保持压力不变，调节磁场强度至1.0T收集透过液得样品B；最后调节磁场强度至0.6T收集截留液得样品C，冻干得到样品A 3.97g、样品B 2.86g、样品C 1.98g。

2.3.2 相对分子质量的测定

2.3.2.1 标准曲线的制作

以标准品的重均相对分子质量MW的对数值为纵坐标，保留时间tR为横坐标，用GPC软件得到标准回归曲线lg(MW)=7.319-0.253tR(r=-0.9931)。

2.3.2.2 样品相对分子质量的测定

高效凝胶色谱法分别测定其重均相对分子质量、数均相对分子质量和相对分子质量分布如表2所示。相对分子质量累积分布曲线如图5所示。

表2 样品的重均相对分子质量、数均相对分子质量和相对分子质量分布宽度测定结果Table 2 Mw, Mn and Mw/Mn of fractions A, B and C

样品A中，重均相对分子质量为86317，数均相对分子质量为40375，相对分子质量分布宽度为2.14，相对分子质量在70000～100000的当归多糖占70%左右；样品B中，重均相对分子质量为19989，数均相对分子质量为10359，相对分子质量分布宽度为1.93，相对分子质量在10000～30000的当归多糖占95%左右；样品C中，重均相对分子质量为62461，数均相对分子质量为31267，相对分子质量分布宽度为2.00，相对分子质量在50000～70000的当归多糖占80%左右。

由此得出，在压力0.2MPa条件下，通过改变磁场强度，实现了一张膜对不同相对分子质量当归多糖的连续分级分离。

图5 样品A、B、C相对分子质量累积分布曲线Fig.5 Cumulative weight distribution curve of molecular weight for fractions A, B and C

3 结 论

水法浸提得到的当归多糖粗提物，经截留相对分子质量为10000和100000的聚砜超滤膜纯化后，得纯度为97.5%的白色当归多糖。

采用原位生成法，以截留相对分子质量为80000的聚砜超滤膜作为基膜制备得到磁性超滤膜。以葡聚糖为基准物，测定此膜在0.2MPa、0.0～1.0T条件下的截留相对分子质量可调控范围为31000～73000。

用此磁性超滤膜对纯化后当归多糖进行分级分离，不同磁场强度下收集截留液或透过液，冻干得到3个样品，高效凝胶色谱对样品进行测定。其中A样品质量3.97g、Mw为86317、相对分子质量在70000～100000的当归多糖占70%左右；B样品质量2.86g、Mw为19989、相对分子质量在10000～30000的当归多糖占95%左右；C样品质量1.98g、Mw为62461、相对分子质量在50000～70000的当归多糖占80%左右。

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Use of a Magnetic Ultrafiltration Membrane for the Separation of Angelica sinensis Root Polysaccharides

XIE Hui-ming，ZHU Ying-ying*，ZHANG Shi-fa，WU Zhi-gang
(Engineering Research Center of Bio-Process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

A magnetic ultrafiltration membrane whose molecular weight cut-off (MWCO) can be between 31000 and 73000 under 0.2 MPa pressure and varying magnetic field intensity was prepared by in situ synthesis on the basis of a polysulfone ultrafiltration membrane with a MWCO of 80000 and used sequentially separate Angelica sinensis root polysaccharides with a purity of 97.5%. As a result, three fractions were obtained under various magnetic filed intensities and named as A, B and C, respectively. Their respective weight average molecular weights (Mw) were determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC) to be 86317, 19989 and 62461. Polysaccharides with a relative molecular weight ranging from 70000 to 100000 was 70% in fraction A. Roughly 95% of fraction B consisted of polysaccharides with a relative molecular weight between 10000 and 30000. Fraction C contained approximately 80% of polysaccharides whose molecular weight was in the range of 50000-70000.

polysaccharides from the root of Angelica sinensis；magnetic ultrafiltration membrane；high performance gel permeation chromatography (HPGPC)；continuous separation

TQ315

A

1002-6630(2011)14-0011-05

2010-07-26

国家“863”计划项目(2007AA100404)

谢慧明(1955—)，女，教授，博士，研究方向为农产品加工及贮藏。E-mail：xiehuiming-6@163.com

*通信作者：朱莹莹(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂及蛋白质工程加工。E-mail：zhuyingying0914@gmail.com