布拉酵母菌高生物量菌株的诱变及选育

楚 杰 王子辉 刘可春 何秋霞

布拉酵母菌高生物量菌株的诱变及选育

楚 杰 王子辉 刘可春 何秋霞

布拉酵母菌是一种能防治急性、慢性及抗生素相关性肠炎的益生酵母菌。但是，作为微生态生物制剂，要想保证其生物疗效作用，活菌数必须达到一定水平。本试验通过自然复壮和紫外诱变的方法，筛选高生长量的布拉酵母菌株。结果表明：与原始的布拉酵母菌菌种作对比，所得菌种的生物量及平板菌落数，分别提高16.6%和36.7%。

布拉酵母菌；复壮；诱变

布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)是在印尼水果荔枝中分离得到的一种益生酵母菌,它具有耐热性，能在37℃温度下生长，属于酿酒酵母的亚种[1]。曾被广泛应用于人类治疗腹泻的药物中[2-3]，它对各种肠道炎症有很好的治疗作用，对小儿腹泻及旅行者腹泻疗效尤为显著。其生物制剂应用于畜牧业中，可以有效降低病原菌及其毒素浓度，十分有利于动物健康快速的生长。另外，酵母细胞内含有丰富的蛋白质、氨基酸以及多种维生素，尤其是B族维生素以及各种消化酶类[4]，是各种动物生长必需的营养物质，将其作为饲料添加剂使用，对动物的生长十分有益，故其在畜牧业中必将有广阔的应用前景。但是，作为微生态生物制剂，要想保证其生物疗效作用，肠道内活菌数必须达到一定水平[5]，因此，本试验通过自然复壮和紫外诱变等方法，以测定生物量含量为指标，对布拉酵母菌株进行了筛选及优化，从而进一步提高布拉酵母菌的生物量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料

布拉酵母菌（本实验室保藏）、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、柠檬酸三铵、磷酸二氢钾、琼脂粉、玉米浆等。

1.1.2 种子培养

以7%的葡萄糖为碳源，0.7%的磷酸氢二铵为氮源，1.0%的玉米浆为生长因子，0.2%的磷酸二氢钾为无机盐配制种子培养基，500ml三角瓶装量100ml，无菌条件下挑取三环布拉酵母菌斜面菌种接入种子培养基中，30℃、200 r/min摇床振荡培养16 h。

1.1.3 摇瓶发酵培养

发酵培养基同1.1.2，将种子培养液按10%的接种量接种于发酵摇瓶培养基中,30℃、200 r/min摇床振荡培养18 h。

1.1.4 生物量的测定

将1.1.3中发酵液5000 r/min离心10 min，收集菌体，用生理盐水洗涤两遍，称重。

1.2 试验方法

1.2.1 自然复壮及筛选（复壮后优质菌种选取）

1.2.1.1 自然复壮

取一只原始菌株z，在无菌条件下加入10ml无菌水做成菌悬液，然后做10-5、10-6稀释度，吸取0.1ml于装有定量固体培养基的培养皿中，用刮刀涂布均匀，在30℃的培养箱内培养2d。从中挑取28个菌落形态比较大的菌落接斜面，培养2 d后备用并编号(z1-z28)。

1.2.1.2 复壮后菌种的初筛及复筛

分别将菌种z1-z28接种种子培养基，30℃、200 r/min摇床振荡培养16h，按10%的接种量接种于发酵摇瓶培养基中,每个菌种重复3瓶，30℃、200 r/min摇床振荡培养18h。按1.1.4方法测定生物量。

从上述试验中选取7株生物量相对较多的菌种做复筛。根据所得结果，从上述7支菌种中选取1株最好的菌种做紫外诱变试验。

1.2.2 紫外诱变及诱变后优质菌种的选取

1.2.2.1 紫外诱变

取自然筛选中已选定的试管斜面种子z20，在无菌条件下加入10m l无菌水做成菌悬液，然后做10-5稀释度，吸取0.1ml于装有固体培养基的培养皿中，用刮刀涂布均匀，将涂布好的平板分成7组，每组6个，在超净工作台的紫外灯下分别照射10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s，剩余的 6 个平板作对照。照射完毕，用黑色的不透光纸包好，放入30℃培养箱内培养2 d，取出观察菌落生长情况并计数。

从中选取49个菌落形态较大的菌落接斜面，培养2d后备用，编号：z20－1 到 z20－49。

1.2.2.2 诱变后菌种初筛及复筛

分别将菌种z20－1到z20－49接种种子培养基，30℃、200 r/min摇床振荡培养16 h，按10%的接种量接种于发酵摇瓶培养基中,30℃、200 r/min摇床振荡培养18 h。按1.1.4方法测定生物量。

从上述49株菌种中选取5株生物量提高相对较多的菌种做复筛。复筛时每株菌做3个重复。

1.2.3 诱变菌株与原始菌种的对比试验

将诱变菌株与原始菌种同时上摇床，按1.1.4测定生物量。并进行比较。

1.2.4 诱变菌株的遗传稳定性试验

将诱变菌株每隔一个月传代一次，再同时与原始菌株同时上摇床，连续传代6次，观察其遗传稳定性。

2 结果与讨论

2.1 布拉酵母菌菌种自然复壮

2.1.1 自然复壮后菌种的初筛(见表1)

表1 自然复壮菌种初筛结果

从表 1 可以看出，28 株菌种中,z2、z7、z9、z12、z15、z16、z207株菌种的生物量及菌落数与其它菌种相比相对较高，故选取这7只菌做复筛。

2.1.2 自然筛选后菌种的复筛(见表2)

表2 自然复壮菌种复筛结果

由表2可知，z20不仅生物量高，而且菌落数含量相对较高，故选取z20作为紫外诱变的菌种。

2.2 紫外诱变及诱变后菌种的筛选

2.2.1 紫外诱变(见表3)

从表3可以看出，随着诱变时间的增加，致死率也随之上升。当诱变时间为60 s时，致死率达到72%。因此，我们从表3中的平板选取较大的菌落接斜面，共 49 株，编号为 z20－1 到 z20－49。

表3 紫外诱变结果

2.2.2 紫外诱变后菌种的初筛(见表4)

表4 紫外诱变后菌种初筛结果

从表 4 中可以看出，z20-2、z20-22、z20-26、z20-31、z20-41菌与其余菌种相比，生物量和菌落数含量相对较高，故选取这5株菌种做复筛。

2.2.3 紫外诱变后菌种的复筛(见表5)

表5 紫外诱变后菌种复筛结果

从表5中可以很明显地看出，菌种z20-41生物量及每毫升菌落数明显高于其它菌种，故选取z20-41作为试验的目的菌种。

2.3 与原始菌种的对比试验(见表6)

表6 优化菌种与原始菌种对比试验

从表6中可以看出，诱变菌株z20-41不论是生物量还是菌落数含量均明显高于出发株。

2.4 诱变菌种的遗传稳定性试验(见表7)

表7 诱变株的遗传稳定性试验

从表7中可以看出，经半年连续传代6次，诱变菌株的生物量比原始菌株高，平均提高16.6%。菌落平板计数提高36.7%，因此，该菌株具有遗传稳定性。

3 结论

本试验通过自然复壮和紫外诱变的方法，对布拉酵母菌高生物量菌株进行筛选，结果表明：所得菌种的生物量及菌落数含量与原始的布拉酵母菌菌种作对比，数值明显提高，经6个月传代稳定性试验，该菌种具有遗传稳定性，且生物量与菌落数含量平均比原始菌株提高16.6%和36.7%。

布拉酵母菌是一种真菌，其生物学特性与细菌完全不同。常规微生态制剂易受抗生素、胃酸、胆汁的影响，应用受到限制，而布拉酵母不会被胃酸、胆酸、抗生素等所破坏，因此应用较广泛。

[1]Dorota C,Patrick R.Experimental effects of S.boulardii on diarheal pathogens[J].Microbes Infect.,2002,4(8)：733-739.

[2]胡祥英.布拉酵母菌治疗小儿轮状病毒肠炎53例临床研究[J].中国微生态学杂志，2002，14(6)：352-354.

[3]Kirchhelle A,Fruhwein N,Toburen D.Treatment of persistent diarrhea with S.boulardii in returning travelers.Results of a prospective study[J].Fortschr Med.,1996,114(11)：136-140.

[4]朱宏娟,田科雄,李玲，等.酵母在饲料工业中的新应用[J].饲料工业，2005，26(12)：4-7.

[5]刘吉成,王惠艳,刘伯阳.双歧杆菌模拟胃肠环境中抗性的研究[J].中国微生态学杂志,2003,15(3)：147-149.

（编辑：刘 占，laram ie_liu@yahoo.com）

Mutagenesis and screening of saccharomyces boulardii containing high biomass strains

Chu Jie,Wang Zihui,Liu Kechun,He Qiuxia

Saccharomyces boulardii is a nonpathogenic yeast,which could exert therapeutic properties in acute and chronic enteritis,antibiotic-associated diarrhoea.Abundant data have suggested that amount of viable organism agent of saccharomyces boulardii plays an important role in the initiation and development of the intestinal disease.The aim of the study is to acquire the resistive strains of Saccharomyces boulardii by rejuvenation and UV mutagenesis,which contain high trehalose and biomass.The presentwork indicates that compared with the biomass and the content of trehalose before optimization，biomass is improved approximately at 16.6%,and the content of trehalose is improved approximately at 36.7%.

saccharomyces boulardii；rejuvenation；mutagenesis

S858.291

A

1001-991X（2011）16-0052-04

楚杰，山东省科学院生物研究所，研究员，250014，济南市经十路科院路。

王子辉、刘可春、何秋霞，单位及通讯地址同第一作者。

2011-06-13

山东省自然科学基金项目[ZR2010CM054]