硅质海绵骨针矿化机制及仿生应用研究进展

王晓红,汪顺锋,甘 露,Ute Schloßacher,周 峰,Klaus P.Jochum,Matthias Wiens,Heinz C.Schröder,Werner E.G.Müller

1)中国地质科学院国家地质实验测试中心,北京 100037;

2)德国美因茨大学医学中心,德国美因茨 55128;

3)德国马－普化学所,德国美因茨 55020

硅质海绵骨针矿化机制及仿生应用研究进展

王晓红1),汪顺锋1),甘 露1),Ute Schloßacher2),周 峰2),Klaus P.Jochum3),Matthias Wiens2),Heinz C.Schröder2),Werner E.G.Müller2)

1)中国地质科学院国家地质实验测试中心,北京 100037;

2)德国美因茨大学医学中心,德国美因茨 55128;

3)德国马－普化学所,德国美因茨 55020

硅质海绵动物是地球上最简单、最古老的多细胞动物,它经几百万年的自然进化成就了适应自然和接近完美的技术蓝图,为人类利用纳米生物技术仿生合成生物无机矿物材料提供了一种崭新的节能和“环境友好”技术,在光纤、微电子和生物医学材料等领域具有广阔的仿生应用前景。生长在深海1000 m以下水深的单根海绵动物的根须骨针长达3 m,是世界上最长的生物硅,也是生物硅化机制和仿生应用研究不多见的载体。本文系统总结了我们在单根海绵动物根须骨针结构、组成、机械性能、光物理性能、生化特性和分子生物学基础、矿化机制和生物医学领域仿生应用等方面的研究成果。

海绵动物; 六放海绵动物; 根须骨针; 生物硅; 硅蛋白; 生物硅化

仿生学是一门相当年轻的科学,但是,生物界经几百万年的自然进化造就了与自然和生存环境和谐共存、选择发展的各种优异性状和功能品质,给人类社会带来了全新的设计理念和接近完美的技术蓝图,成为人类社会发展取之不尽的知识宝库,因此,一经问世就显示了极强的生命力。利用生物矿化机制仿生合成生物无机矿物是一种崭新的节能和“环境友好”技术,是我国乃至世界“低碳资源”研究新领域。

硅质海绵动物在自然条件(常温、常压和硅含量极低的中性海水环境)下由硅蛋白/酶催化合成纯的生物二氧化硅(骨架/骨针),有望彻底改善目前硅材料生产需要高温、高压和腐蚀性化学试剂参与的传统工艺,在光纤、微电子和生物医学材料领域具有广阔的仿生应用前景(Chael a1.,1999; Kraskoet al.,2000; Mülleret al.,2007)。

20世纪90年代,意大利生物学家发现了硅质海绵骨针的光纤特性(Gainoet al.,1994),特别是21世纪初美国科学家进一步指出了这些特性将给人类制造光纤带来新思路(Sundarel a1.,2003; Aizenberget a1.,2004),便很快引起了科学家们对硅质海绵骨针结构、特性、生长机制与调控的生物学、生矿物学以及仿生学的广泛研究兴趣(王晓红等,2006,2007)。但是，系统的工作主要是针对可在实验室培养的寻常海绵动物Subrites domuncula进行的(Mülleret al.,2007a)。

我国拥有丰富的六放海绵动物资源,特别是单根海绵动物骨针标本,近来我们有幸在我国南海2000多米水深采集到了世界上最长的单根海绵动物根须骨针(2.5 m),使得我们的研究工作取得了突破性进展。本文就是对这些珍贵样品研究成果的总结。

1 单根海绵动物及其发现

单根海绵动物生活在深海环境中,一根巨大的根须骨针扎根在沉积物中支撑着椭圆形的身体(图1A,F),它们从流过身体沟道系统的水流中获取营养物质而生存。单根海绵动物的根须骨针可长达3 m,代表了地球上最长的生物硅结构。

德国“瓦尔迪维亚(Valdivia)”号在1898—1899年的深海探险中首次在东非海岸索马里盆地1644 m水深发现了单根海绵动物。这个标本有一根约 3 m长的巨大的根须骨针,并由一根同样长的伴骨针环绕,成为这次深海探险最重要的收获之一(图1),但后人一直没有见到实物。Schulze(1904)对该单根海绵动物(Monorhaphis)标本进行了详细描述和拍照。另外,他用草图勾画了单根海绵动物不同生长期的形态变化: 年轻的单根海绵动物整个的根须骨针都被软组织包裹,但随着个体的生长,根部的软组织逐渐消退,年老的个体的根须骨针底部暴露(图1B)。单根海绵动物身体的一侧有许多开口(图 1C-E),通过这些开口,可以观察到内部有序的骨架结构(图2)。

2008年,我们有幸在我国南海采到了一根长达2.5 m的单根海绵动物根须骨针和它的伴骨针,根须骨针中部的直径约为1 cm,底部的直径约为0.3 cm,伴骨针略短也略细,最大直径约0.5 cm(Wanget al.,2009a)。

2 单根海绵动物骨针的多样性和结构

单根海绵动物与其它所有六放海绵动物一样,其骨架由大骨针(0.2 mm～3 m)和小骨针(＜0.1 mm)组成,具有支撑和保护身体的功能。一根巨大的根须骨针和一根伴骨针一起构成了单根海绵动物的主要骨架。另外,在单根海绵动物中还找到了14种长度从几微米到 50毫米不等的骨针(Mülleret al.,2007b; Schulze,1904; Tabachnick,2002)。

单根海绵根须骨针一般由外围无机硅层和中心有机轴丝(af)组成(图3A,B; Wanget al.,2009a)。无机硅层又分为三个部分,即中间存放轴丝的轴洞(ac),围绕轴洞直径约为 100～150 μm 的均匀硅层(cy)和外部规则的同心圆状硅薄层(la),每硅薄层厚约 3～10 μm,根据骨针大小不同可能有 300～1000层的硅薄层(图3C,D)。中心有机轴丝的主要成分是硅蛋白(Silicatein),它既是催化硅质海绵骨针生长的酶也是模板。不同类型的海绵骨针,其轴洞和轴丝截面的形状不同,对于单根海绵根须骨针,其轴洞的为圆形,而轴丝为矩形(图3A,B)。

3 单根海绵动物骨针的化学组成

Sandford(2003)和Müller(Mülleret al.,2007b)等曾经对六放海绵骨针和寻常海绵骨针的化学组成进行了研究; Schulze早在1904年就测定出硅质海绵骨针中除 96%的硅外,只有痕量的Na 和K。最近,我们利用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)技术系统研究了单根海绵骨针截面(直径约 7 mm)中 40多个元素的含量及分布特征(从骨针截面的中心到边缘),发现所有元素的含量在硅质海绵骨针截面中的变化都较小,而且与Si 相比,其它元素的含量都极低,Si以外的其它元素的含量总和仅为SiO2含量的0.005倍,其纯度几乎达到了石英的纯度，而Na 的含量仅为0.21%,与生长于其中、提供其物质来源的天然海水的元素组成(Na: 32.4%,Si: 0.006%)形成了鲜明对比(图 4),展现了生物界的无比威力。

4 单根海绵动物根须骨针的机械性能

Levi等通过对单根海绵骨针的研究认为海绵骨针的多层结构有望改善其机械性能(Leviet al.,1989)。Mayer认为天然生物复合材料中有机相的存在能控制能量损耗,特别是掺杂有有机薄层的无机材料(Mayer et al.,2005)。我们最近利用高分辨扫描电镜(HR-SEM)对单根海绵根须骨针的研究表明,有机质不仅分布在轴洞周围,而且外围的硅层和硅薄层中都有有机质存在(Mülleret al.,2007b)。

为了证实这种具有特殊结构和组成的硅质海绵骨针拥有独特的机械稳定性,我们进行了三点弯曲试验,硅质海绵骨针(直径 2.1～2.6 mm)高温处理(600℃,20分钟)前后的压力－位移对比曲线见图5(Mülleret al.,2007b; Mülleret al.,2008b)。红色的曲线为样品加热前的弯曲曲线,样品的断裂经历了A、B、C和D几个特征点,是一个逐步断裂的过程,样品的弯曲性能好; 而黑色的曲线为样品加热后的弯曲曲线,和普通的玻璃丝一样其断裂过程是一个瞬间过程,样品很脆,弯曲性能差。硅质海绵骨针经过高温处理,有机质消失,样品变脆,说明硅质海绵骨针除了同心圆多层结构外,有机质的存在对其韧性,即弯曲性能有很大影响。

5 单根海绵动物根须骨针的光物理性能

海绵动物利用其复杂的细胞－细胞和多样化的细胞－基质反应系统,通过身体收缩或扩张对外界的物理刺激做出迅速回应(Mülleret al.,2004)，这些通常是神经系统的功能,但是，科学家们一直没有在海绵动物中找到构成神经系统的神经纤维或神经键。

后来,科学家们把海绵动物信号系统研究的目光转向了光系统,因为 20世纪 70年代就已经发现无论是海绵动物胚胎还是海绵动物都会对光的刺激做出反应(Mackie,1979; Pavans de Ceccatty,1974);Leys等还发现海绵动物可辨别不同波长的光(Leyset al,2001; Leyset al.,2002); Cattaneo-Vietti等和Aizenberg等发现硅质海绵骨针(分别利用Rossella racovitzae和Euplectella aspergillum)可以导光(Aizenberget al.,2004; Cattaneo-Viettiet al.,1996);Müller等发现硅质海绵骨针(Hyalonema sieboldi)对光的传输有选择性(Mülleret al.,2006)。我们研究了单根海绵根须骨针的导光(白光)性能,发现只有600～1400 nm波长的光可以通过,而且由于水分子的存在,在谱图的960 nm和1150 nm处出现了两个小的吸收峰(图6)。

受上述研究成果的启发,我们在硅质海绵动物中分离和鉴定出了发光蛋白——荧光素酶(Luciferase)和受体蛋白——隐形素(Cryptochrome),从而在硅质海绵动物中找到了具有神经系统功能的光传感系统: 发光蛋白——荧光素酶发光,通过导光系统——骨针传输光,最后受体蛋白——隐形素接收光而传递信号,对外界刺激作出实时反应(图7;Mülleret al.,2009a,2010)。

6 生化特性和分子生物学基础

6.1 生化特性

用 HF溶解硅质层是从硅质海绵骨针中提取硅蛋白常用的方法。我们采用适量的 HF小心溶解单根海绵根须骨针外面的硅层(硅层溶解后立即中断溶解过程),通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定出了24-27 kDa的低分子量蛋白带(Wanget al.,2008)。

为了证明该蛋白确实是硅蛋白,我们做了一系列的生化实验。发现27 kDa大小的蛋白与硅蛋白的抗体发生交叉反应,更重要的是其中的提取物与寻常海绵的寄居蟹皮海绵(Suberites domuncula)中的提取物类似,都有蛋白水解酶活性。而且,这种提取物的蛋白水解酶活性能被巯基蛋白酶抑制剂E-64抑制(Mülleret al.,2008c)。

此外,我们从单根海绵根须骨针中检测出了第二种有机物,半乳糖凝集素。对寄居蟹皮海绵骨针的研究表明,胞外硅蛋白分子与半乳糖凝集素分子密切相关,它们共同参与硅质海绵骨针硅层的生长/矿化(Schröderet al.,2006)。为此,我们利用标准的血凝试验,检验了单根海绵根须骨针提取物的凝集素活性。将马血中的红细胞置于单根海绵根须骨针提取物中,结果发现当红细胞浓度超过2.5 μg/ml时会出现明显的红细胞凝集现象(Wanget al.,2007)。

6.2 六放海绵中硅蛋白基因的cDNA克隆

如前所述,单根海绵动物根须骨针中含有与寻常海绵动物具有相似酶活性的物质。遗憾的是未能采集到新鲜的单根海绵组织样品,仅利用博物馆收藏的样品未能成功克隆出硅蛋白的cDNA编码序列。为此,我们利用六放海绵动物的另一个物种Crateromorpha meyeri的新鲜组织样品,从中获得了其硅蛋白的cDNA编码序列(Mülleret al.,2008d)。发现作为硅蛋白特征氨基酸片段催化三联体的丝氨酸(aa 22)、组胺酸(aa 161)和天冬酰胺残基(aa 181)出现的位置与寻常海绵寄居蟹皮海绵的硅蛋白-α和贝加尔湖淡水海绵硅蛋白-α3中催化三联体出现的位置完全一致(Mülleret al.,2007c)。但是,除了常规的丝氨酸基团外,这种六放海绵多肽中还包含有第二个丝氨酸基团,这个基团被称作六放海绵动物特有的含有 5个残基的丝氨酸基团,它出现在六放海绵基因序列中氨基酸残基aa 169 与aa 173之间的区域。六放海绵动物硅蛋白基因序列中包含了肽酶-C1木瓜家族半胱氨酸蛋白酶结构域,与荔枝海绵(Tethya aurantium)和寄居蟹皮海绵中硅蛋白-β基因序列具有高度的相似性(期望值E＝8e-58),但与淡水海绵Leuciscus baicalensis基因序列相似性较低(E＝2e-47)(图 8; Wanget al.,2009b)。

迄今为止,我们未能获得确凿的实验数据解释六放海绵动物特有的丝氨酸基团在硅蛋白分子中的潜在作用。但最近的研究发现,与硅藻系统类似,这些丝氨酸基团通过侧链上的羟基基团与单个的硅酸分子发生作用(Müller et al.,2008a)。因此,我们推测六放海绵动物特有的丝氨酸基团和常规的丝氨酸基团一起起着稳定硅蛋白和聚硅酸表面之间反应的作用。

7 单根海绵根须骨针的生长/矿化机制

海绵是世界上最简单的多细胞动物,但是不同种属的海绵动物其骨针的大小和形状各不相同,其骨架/骨针的生长/矿化机制相当复杂。

前人研究表明,硅蛋白可催化生物硅的矿化,而胶原蛋白和凝集素参与生物硅形态的调控。我们成功地从单根海绵骨针中分离和鉴定出了硅蛋白,又利用 SEM 技术我们在单根海绵骨针表面找到了一层胶原蛋白鞘(表面有直径约7～10 μm的规则圆孔)(Mülleret al.,2007d)。在单根海绵根须骨针结构、组成和分子生物学等研究成果的基础上,我们总结出了其矿化机制(图9; Wang et al.,2009a)。

单根海绵动物根须骨针的生长/矿化包括两个方面: 横向的增粗(图 9B)和纵向的增长(图 9C)。横向生长如图 9B所示,中心轴洞里为由硅蛋白/酶组成的轴丝(af; 红色),它既是硅质海绵骨针生长/矿化的模板又是催化剂; 通过硅蛋白的催化作用由正硅酸盐(si)合成包裹在轴丝外面的均匀硅层(cy); 硅层外面附有一硅蛋白层(sil; 红色椭圆),硅蛋白层由外面的凝集素分子层稳定 (lec; 黄色椭圆),而凝集素分子层的方向由包裹其外面的胶原蛋白层控制(col; 灰色纤维结构),通过反馈耦合机制形成一层层硅薄层构成硅薄层区,骨针增粗。而纵向生长如图9C所示: 六放海绵骨针顶端有一开口,轴丝向上生长,硅蛋白从顶端释放出来催化形成锥形结构的硅薄层,硅薄层从顶端到根部生长,与顶端封闭的寻常海绵骨针的生长/矿化机制不同(Mülleret al.,2005; Schröderet al.,2006)。

8 硅质海绵骨针的仿生应用

硅质海绵骨针的生长由基因控制,其中起关键作用的就是硅蛋白(Chaet al.,1999; Kraskoet al.,2000)。在明确了海绵骨针生长和矿化机制的前提下,Müller教授研究小组发展了硅蛋白的重组技术(Mülleret al.,2004),将其广泛应用于光纤、微电子和生物医学材料等纳米生物技术领域。这里重点介绍我们仿生制备生物医学材料的新进展。

通常而言,生物硅是自然生态系统中最基本的营养物质(Struyfet al.,2009),它对人类和其他脊椎动物尤其重要(Carlisle,1986; Dycket al.,2000),硅缺乏会导致严重的骨骼畸形(Carlisle,1972)。对于禽类,与心脏和肌肉组织相比,结缔组织中的硅含量最高。动物骨骼的形成与硅的累积可以建立一定的空间相关性,在类骨质周围和类骨质与骨质界面可检测到大量的硅,表明这种无机成分对骨的形成至关重要。为此,Schröder等深入研究了生物硅对成骨细胞活性的影响。实验表明,在有生物硅存在的β-磷酸甘油(一种磷酸脂)中培养成骨肉瘤细胞SaOS-2,其矿化活性增强(Schröderet al.,2005)。值得注意的是,如果生物硅和Ι型胶原蛋白同时存在,不仅细胞中磷酸钙的沉积增加,而且还刺激细胞的增殖。我们考察了生物硅和硅基化合物对控制牙釉质形成关键基因表达的影响,研究发现硅基化合物的存在会增强标识基因的表达，HR-SEM可观察到有生物硅存在的细胞中羟磷灰石的沉积增加 (Mülleret al.,2007e)。在上述研究工作的基础上,首次尝试硅蛋白/生物硅在生物医学领域的应用(骨骼/牙齿修复和牙齿保健 )取 得成功 (图 10)。硅蛋白与偏硅酸钠作用可在牙齿(猪牙齿; 图Fig.10C,D)和骨骼(老鼠腿骨,见图 10E,F)表面沉积生物硅层(50～150 nm),这样就可以在牙齿表面形成一层生物硅保护膜,从而减少细菌的侵蚀而不会导致龋齿/蛀牙;通过生物硅刺激矿化细胞的活性而增加羟基磷灰石的沉积可修复骨组织(Mülleret al.,2009b,Wienset al.,2010a)。

最近,我们已经初步仿生合成了一种具有生物活性能诱导骨骼再生的新型骨修复材料(图 11)。这种材料由可塑性的支架和将硅蛋白包裹其中(保持硅蛋白的活性)的聚D,L乳酸/聚乙烯吡咯烷酮交联共聚物微球体组成。这种材料具有生物兼容性和降解性,植入兔腿骨后,材料本身降解,刺激羟磷灰石沉积,实现骨再生,最后创伤基本修复(Wienset al.,2010b)。此外,生物硅还是治疗和预防骨质疏松的一剂良药(图12; Wienset al.,2010c)。生物硅诱导基因的表达有选择性,可诱导破骨细胞抑制因子(OPG)的表达,而不诱导破骨细胞分化因子(RANKL)的表达(Wienset al.,2010c),最终从成骨细胞中释放出的OPG的数量增加,使得胞外区OPG与RANKL结合导致 RANKL不能与其受体 RANK(核因子-κB受体活化因子)结合,RANKL功能的消失抑制破骨细胞的分化和骨吸收,从而避免骨质疏松症的产生。下一步将进行动物实验检验其生物学效应。此外,也会考虑聚合硅和其它无机聚合物,特别是无机多磷酸盐的综合作用(Leyhausenet al.,1998;Schröderet al.,2000b; Lorenzet al,2001; Mülleret al.,2011)。

9 结语

硅质生物体在自然条件下搭建纳米到米量级范围的形态各异的骨架结构,为人类硅材料生产提供了全新的设计理念。近年来,生物硅化过程中起关键作用的酶(海绵动物中的硅蛋白 silicateins)和蛋白质/多聚胺(硅藻中的亲硅蛋白 silaffins)的发现将无机化学和生物化学紧密相联,生物硅化机制和仿生应用研究取得了初步进展,更重要的是未来的前景相当广阔,特别是在生物医学材料领域的应用将是一项影响深远的工作。

我国是一个拥有13亿人口的大国,而且老年人占了相当的比例,据统计65%的人都患有龋齿,每年有大约45万骨移植手术,因此,对生物医学材料,特别是具有优良性能的生物医学材料的需求是巨大的。

2010年在德国教育与研究部的支持下成立了德中合作实验室,为德中深入、持久的合作搭建了一个良好的平台。中德双方将在未来几年内继续利用“绿色”的仿生技术研究制备具有优良性能的硅基生物医学材料/药物,为人类健康服务。

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Advances in Research on Siliceous Sponge Spicules: Novel Insight into the Understanding of Biomineralization Mechanisms and Bionic Applications

WANG Xiao-hong1),WANG Shun-feng1),GAN Lu1),Ute Schloßacher2),ZHOU Feng2),Klaus P.Jochum3),Matthias Wiens2),Heinz C.Schröder2),Werner E.G.Müller2)
1)National Research Center for Geoanalysis,Chinese Academy of Geological Sciences,Beijing100037;
2)Medical Center of the University of Mainz,Mainz,Germany55128;
3)Max-Planck Institute for Chemistry,Mainz,Germany55020

Siliceous sponges are the simplest and oldest multi-cellular animals on the Earth.They achieved a perfect technical blueprint during their million years of evolution.A new energy-saving and environmentally friendly technology has been developed by nature for human applications allowing the production of novel bio-inorganic mineral materials using nano-biotechnological approaches.There is a wide application prospect in the fields of optical fibers,microelectronics,biomedical materials and some further areas.Monorhaphis chunilives in the deep sea over 1000 m in depth.Its giant basal spicule is growing to a length of 3 m and is therefore the largest bio-silica structure on the Earth.It is a highly suitable model for the study of bio-silicification mechanisms and for their bionic applications.In this paper,the authors systematically summarize the research progress in these giant basal spicules on the following topics: structure,composition,mechanical properties,optophysical properties,biochemical properties and molecular biological basis,biomineralization mechanism as well as bionic applications in biomedicine.

Sponge; Hexactinellida; giant basal spicule; bio-silica; silicatein; biosilicification

Q915.812; Q915.4; Q919 文献标志码: A doi: 10.3975/cagsb.2011.02.01

本文由科技部国际合作项目“硅质海绵骨针矿化机制及仿生研究”(编号: 2008DFA00980)、国土资源部公益性专项“生物-硅化仿生新矿物材料应用研究”(编号: 201011005-6)、德国教育与研究部德中合作实验室项目(编号: CHN 09/1AP)、欧盟研究委员会(ERC)高级领军人才项目(编号: 268476 BIOSILICA; Müller教授为受助者)联合资助。获中国地质科学院2010年度十大科技进展第三名。

2011-03-07; 改回日期: 2011-03-09。责任编辑: 魏乐军。

王晓红,女,1969年生。研究员,博士。长期从事海洋地球化学分析技术研究和标准物质研制工作,近年来与德国美因茨大学Müller教授研究小组合作开展硅质海绵骨针矿化机制与仿生应用研究工作。通讯地址: 100037,北京市西城区百万庄大街26号。电话: 010-68999596。E-mail: wxh0408@hotmail.com。