大豆异黄酮对AD大鼠海马PS-1表达的影响

方正清，刘长安，汪远金，朱 洁，白 玫

(安徽中医学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230038)

大豆异黄酮对AD大鼠海马PS-1表达的影响

方正清，刘长安，汪远金，朱 洁，白 玫

(安徽中医学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230038)

目的：探讨大豆异黄酮(SIF)对AD大鼠海马PS-1表达的影响。方法：采用β-淀粉样蛋白(Aβ)单侧海马注射建立阿尔茨海默病(AD)大鼠模型，给予相应药物后，利用跳台实验观察AD大鼠学习记忆能力的变化，免疫组化检测AD大鼠海马早老素(PS-1)表达。结果：大豆异黄酮可改善AD大鼠的学习记忆能力(P＜0.01)，显著性降低AD大鼠PS-1表达(P＜0.01)。结论：大豆异黄酮显著降低AD大鼠海马组织PS-1表达，从而改善AD大鼠学习记忆能力。

大豆异黄酮；阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白；PS-1

大豆异黄酮(soybean isoflavones，SIF)来源于大豆的植物雌激素，是具有弱雌激素作用的杂环多酚类化合物，其主要成分是三羟异黄酮(genistein)、二羟异黄酮(daidzein)和甲氧基大豆素(glycitein)。其结构与17β-雌二醇相似[1]，可与雌激素受体(ER)结合，表现弱的类雌激素样作用。曾经报道大豆异黄酮能改善骨质疏松作用[2]。阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)的发病与早老素基因(presenilin，PS)的突变有关，早老素PS1和PS2的突变参与了AD的老年斑(senile plaque，SP)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)的形成。本实验应用Aβ25～35诱导制备AD模型，给予不同剂量的大豆异黄酮，观察其对大鼠海马组织PS-1表达的影响，探讨大豆异黄酮改善学习记忆功能的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

10月龄雌性Wistar大鼠60只，体质量250～350g，由河南省实验动物中心提供[合格证(豫)093273]。

大豆异黄酮(SIF，纯度为84%，批号060104，临用时用0.5%羧甲基纤维素钠配成混悬液) 华北制药股份有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，批号F20041221) 国药集团化学试剂有限公司；β-淀粉样蛋白(Aβ25～35，批号 108K4794) 美国Sigma公司；戊酸雌二醇片(批号142A) 法国DELPHARM Lille S.A.S药厂；早老素蛋白抗体、免疫组化染色试剂盒(HistostainTM-Pllus Kits，批号010686) 北京博奥森生物技术有限公司。

NS型脑立体定位仪 日本Narishige公司；CX21FS1型光学显微镜 日本奥林巴斯公司；Image-Pro Plus 5.1图像处理软件。

1.2 方法

1.2.1 造模

参照大鼠脑立体定位图谱[3]方法，大鼠用10%水合氯醛380mg/kg(以体质量计)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，头顶部正中切口暴露前囟，以前囟为原点，向后4.4mm，旁开2.2mm为穿刺点，钻孔穿颅，自脑表面进针3.0mm至右侧海马，用微量注射器将Aβ25～35 1μL (10μg) 5min缓慢注入，留针5min，以使Aβ25～35充分浸润局部组织，假手术组注射等量的生理盐水。退针后缝合伤口，术后腹腔注射青霉素钠防止感染，常规饲养。

1.2.2 分组及给药

实验大鼠随机分为6组：模型组(OVX)、大豆异黄酮高剂量组(9mg/kg，Sif-H)、大豆异黄酮中剂量组(3mg/kg，Sif-M)、大豆异黄酮低剂量组(1mg/kg，Sif-L)、假手术组(Sham)、雌二醇组(0.4mg/kg)，每组10只。各组动物均在相同环境中，自由摄食和饮水，除Sham组外，其余5组在造模3d后给药，Sif 3组和雌二醇组每天灌胃给相应药物(2mL/只)，OVX组给予等体积的0.5% CMC-Na灌胃，连续21d。

1.2.3 取材

各组动物3周后，大鼠经10%水合氯醛380mg/kg腹腔注射麻醉后，用4%多聚甲醛经心脏行灌注固定：麻醉，剪开胸廓，见到搏动的心脏，心尖插入灌注针头，止血钳固定，剪开右心耳，开放静脉血，首先快速滴入生理盐水100～200mL，再注入4%多聚甲醛300～350mL固定液进行固定，取脑后再置于4%多聚甲醛固定，待测大鼠脑组织海马PS-1的表达。

1.2.4 指标检测

1.2.4.1 大豆异黄酮对AD大鼠跳台实验的影响

大鼠学习记忆能力用跳台实验进行检测，手术后13d开始跳台实验，跳台仪装置为50cm×30cm×30cm的被动反射箱，用塑料板隔成4间，箱底为铜栅，可以通电，电压为36V，箱正中央放置高和直径均为415cm的橡皮垫，作为大鼠逃避电击的安全区。训练及测试时将大鼠放入箱中适应3min，接通电源，大鼠受到刺激后跳到平台上躲避电击，若未跳到平台则为错误反应。动物从跳到平台上至第一次跳下的时间为潜伏期，每次训练或测试时间为5min。大鼠第一次跳下来平台的潜伏期即为其行为学测试成绩。每天上、下午各训练一次，训练5d，记录第6天测试成绩并进行比较。

1.2.4.2 免疫组化SP法检测大鼠脑组织海马PS-1的表达

将固定的脑组织进行常规脱水、透明、包埋、切片、脱蜡至水。3% H2O2溶液孵育10min以灭活内源性过氧化物酶；0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)微波热修复抗原；滴加一抗，37℃水浴箱孵育40min；滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体，37℃水浴箱孵育20min；二氨基联苯胺(DAB)显色；蒸馏水冲洗终止显色，苏木精轻度复染，脱水，透明，封片；用正常羊血清代替一抗作阴性对照。

每张切片在显微镜下随机取4个高倍视野观察海马CA1、CA2、CA3、CA4区域并拍照。神经元胞质及突起内染棕黄色为PS-1阳性表达， 采用Image-Pro Plus 5.1图像处理软件统计阳性表达的面积及光密度值。

1.2.5 统计学处理

实验数据用x±s表示， 用SPSS 11.0 软件进行统计学处理，显著性检验采用两独立样本t检验和单因素方差分析，以α=0.05作为有显著性的检验水准。

2 结果与分析

2.1 大豆异黄酮对AD大鼠跳台实验的影响

表1 大豆异黄酮对AD大鼠跳台成绩的影响Table 1 Effect of SIF on platform-jumping performance of step down test in AD rats

由表1可知，OVX组与Sham组相比：OVX组逃避潜伏期明显延长，错误次数明显增加，差异均具有显著性(P＜0.01)；各治疗组与OVX组相比：Sif-H组逃避潜伏期显著减少，错误次数显著降低(P＜0.01)；Sif-M、Sif-L组逃避潜伏期明显减少，错误次数明显降低(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠海马PS-1表达

各组大鼠海马组织表达PS-1如图1显示，Sham组大鼠海马组织未见PS-1表达(图 1B)；OVX组大鼠海马组织PS-1呈强阳性表达(图1A)；Sif-H组大鼠海马组织PS-1未见明显表达(图1C)；Sif-M组大鼠海马组织PS-1轻度表达(图1D)；Sif-L组大鼠海马组织PS-1中度表达(图1E)；雌二醇组大鼠海马组织PS-1呈轻、中度表达(图1F)。

图1 各组大鼠海马组织的免疫组化SP法(×400)Fig.1 Streptavidin-perosidase (SP) for hippocampus of AD rats (×400)

表2 大豆异黄酮对AD大鼠海马PS-1表达的影响Table 2 Effect of SIF on the expression of PS-1 in hippocampus of AD rats

如表2所示，OVX组大鼠海马内PS-1阳性表达面积和光密度明显增加，与Sham组比较，有显著性差异(P＜0.01)；大豆异黄酮各剂量组大鼠海马内PS-1阳性表达面积和光密度明显降低，与OVX组比较有显著性差异(P＜0.01)。

3 讨 论

AD是一种较常见的神经系统退行性疾病，病因尚未完全明了，其主要临床特征为记忆减退和认知功能障碍。典型的病理学特征为SP和NFT的形成。具有神经毒性的Aβ在脑实质沉积形成SP[4]，启动病理级联反应，形成NFT，导致广泛的神经元丢失。脑组织的破坏导致功能的损害，出现痴呆症状[5-6]。故认为Aβ是AD各种病理变化和临床表现的始发因素。本实验采用脑内注射Aβ制作AD大鼠模型，并观察到AD模型大鼠学习记忆能力降低，PS-1活性表达增加。大豆异黄酮改善AD模型大鼠学习记忆和降低PS-1活性表达。

3.1 AD大鼠学习记忆的变化

学习记忆实验方法(跳台)，观察了大豆异黄酮对Aβ诱导的实验性AD模型大鼠逃避潜伏期和错误次数法学习记忆能力的影响。结果显示：大豆异黄酮能明显缩短实验性AD模型大鼠逃避潜伏期和降低错误次数，从而提高实验性AD模型大鼠记忆获得率。与AD模型大鼠组相比具有显著性。表明大豆异黄酮有较好的改善实验性AD模型大鼠学习记忆障碍的作用。

3.2 AD大鼠PS-1活性的表达

膜内淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)为Aβ的前体蛋白，它的异常代谢使Aβ生成和聚集增多，进而形成老年斑。β位点剪切酶(BACE)即β分泌酶，它在APP代谢中水解形成长度不等的Aβ40～42片段。γ-分泌酶是β产生所必需的另一个酶，其作用位点对于长Aβ片段的产生及AD的病理过程非常关键。目前认为，γ-分泌酶为多蛋白复合体，PS-1是γ-分泌酶的催化部位和活性基团[7-9]。PS的病理作用是促进Aβ沉积，损伤线粒体，产生自由基，导致钙稳态失调，增加 Tau 蛋白磷酸化及释放调亡因子和提高糖原合成激酶( GSK-3β)活性而诱导细胞凋亡[10]，最终导致SP和NFT的形成。本实验结果显示，模型组PS-1表达显著加强，而大豆异黄酮各组PS-1表达显著降低，说明大豆异黄酮能显著降低AD模型大鼠的PS-1表达，从而减少SP和NFT的形成。

目前AD研究的热点围绕APP基因、PS基因和载脂蛋白E的表达。本实验提示大豆异黄酮可能通过影响AD大鼠PS-1表达来发挥类雌激素样作用。研究大豆异黄酮对AD大鼠PS-1表达的影响，对于寻找AD防治药物有一定意义。所以本实验进一步探讨仍在进行中。

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Effect of Soybean Isoflavone on Presenilin-1 Expression in Hippocampus of Rats with Alzheimer,s Disease

FANG Zheng-qing，LIU Chang-an，WANG Yuan-jin，ZHU Jie，BAI Mei
(Research Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230038, China)

Objective: To explore the effect of soybean isoflavone (SIF) on the expression of presenilin protein-1 (PS-1) in rats with Alzheimer's disease (AD). Methods: AD rat models were established by unilateral hippocampus injection of Aβ. The changes in learning and memory capability of AD rats were measured by step down test, the expression of PS-1 in hippocampus of rats were measured by immunohistochemical method. Results: Soybean isoflavone (SIF) could improve learning and memory capability of AD rats (P ＜ 0.01) by step down test, and significantly decrease the expression of PS-1 (P ＜ 0.01) in hippocampus of AD model group. Conclusion: Soybean isoflavone (SIF) can decrease PS-1 expression and improve learning and memory capability of AD rats.

soybean isoflavone；AD；β-amyloid peptide；presenilin protein-1

R285.5

A

1002-6630(2011)07-0312-03

2010-04-22

安徽省自然科学基金项目(070413259X)

方正清(1968—)，男，副教授，硕士，主要从事中西医结合神经解剖学研究。E-mail：chhzhqfang@126.com