富血小板血浆促进口腔组织再生的影响因素

任明明 综述，柳忠豪 审校

(1. 大连医科大学 研究生院，辽宁 大连 116044； 2. 烟台市口腔医院 种植中心,山东 烟台 264008)

1 富血小板血浆(platelet—rich plasma，PRP)概述

1.1 PRP分子生物学作用机制

PRP是指自体血液经过离心分层后位于白细胞上方富含血小板的血浆部分。Whitman[1]在1997年第一次提出活化的血小板及其释放的生长因子可以加速伤口的愈合。作用机理是当血小板被激活后，α颗粒释放出多种生长因子，主要包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-1)以及血管内皮生长因子(VEGF)等。这些生长因子之间具有协同作用。它们一方面对细胞的增殖、分化、胶原合成和血管再生起着促进作用，一方面抑制破骨细胞的功能，共同维持着组织环境的平衡，对于骨缺损的修复和再生有着重要的作用[2]，其中又以PDGF和TGF-β最为重要。PDGF作为一种促进有丝分裂剂和单核细胞与吞噬细胞的生物趋化因子，是在创伤愈合过程中最早出现的生长因子。它通过与细胞表面特异受体结合，对成骨细胞进行多方面调节，刺激成骨细胞增殖，从而促进骨再生[3]；它还可以刺激血管内皮细胞分裂，加速血管增生，促进移植区的毛细血管生长和胶原蛋白的合成，加速创伤部位的修复[4]。TGF-β可促进前成骨细胞的有丝分裂和趋化，同时抑制破骨细胞的生成和骨吸收，从而对创伤的愈合和骨组织再生起促进作用[5]。

另外，PRP中还富含3种粘结蛋白：纤维蛋白原、纤维连接蛋白和玻璃粘连蛋白，这些蛋白在骨引导过程中起着细胞黏附分子的作用，加速骨形成的速度，从而缩短治疗过程[4]。

1.2 PRP的实验研究及其临床应用

近年来，学者们就PRP进行了大量的动物实验和临床研究。

在促进骨形成方面：Marx[6]于1998年首次把PRP与自体髂骨结合应用于下颌骨缺损重建治疗中，证实PRP能够促进骨的成熟，并有利于形成更高的骨密度。Oqundipe[7]将PRP应用于下颌第三磨牙拔出后的牙槽窝中，发现PRP能够减少术后疼痛肿胀以及牙关紧闭，促进创口骨的形成。 Kroese-Deutman等[8]将PRP和自体骨联合应用于钛种植体的周围，发现其骨愈合的速度快于单纯自体骨移植的组别，认为PRP对于钛种植体周围的骨形成有促进作用；Zhang S等[9]研究证实，PRP能够提高骨髓间质细胞中碱基磷酸酶的活性，加速骨的形成。

在促进牙周组织再生方面，Yilmaz S[10]记录20名慢性进展性牙周病患者接受基础治疗3个月后仍存在3 mm的骨内缺损，牙周探诊深度6 mm，以PRP与冻干牛骨联合应用治疗牙周骨缺损，术前和术后12个月分别测量探诊深度、附着水平、边缘龈退缩、探诊和X线示骨水平进行统计学分析比较，其结果显示术前术后各数据差异均有显著性意义，术后患者的临床检查和X线片显示均表明牙周情况有明显的改善。

另外，PRP还能够促进神经，韧带，上皮，血管等的再生。 Elgazzar等[11]研究发现，PRP能够增加末梢神经纤维再生的数量，加速周围神经的再生速度。

然而，在大部分学者证实了PRP的积极作用的同时，也有学者在PRP的研究中有着不同的发现：Michael M等[12]研究表明，PRP对于骨愈合没有任何明显的促进作用；Arpornmaeklong[13]等体外研究显示PRP在一定剂量时会抑制前成骨细胞的成骨分化，认为PRP在成骨诱导作用上不是BMP-2的替代体。Kazakos[14]在动物实验研究中发现：PRP单独应用或者和GBR技术联合应用都不能加速骨组织的愈合，认为对于PRP的研究应该更侧重于其对软组织、筋腱和韧带的促进作用。

2 影响PRP促进组织再生作用的因素

通过文献回顾，作者发现影响PRP促口腔组织再生实验结果差异的因素可以归纳为以下几类。

2.1 PRP中生长因子的浓度

PRP中血小板的浓度影响成骨细胞的增殖和分化：Choi等[15]将PRP应用于成骨细胞的体外培养，结果发现低浓度(1%～5%)的PRP可以促进成骨细胞的生长。但当其浓度过高时，则会抑制细胞的生长。相同浓度的PRP，不同的用量也在骨形成实验中有不同的发现： Nagata M[16]在大白兔颅骨的缺损中，在缺损区分别覆盖血凝块、自体骨、自体骨分别与50、100、150 μL的相同浓度的PRP联合应用5种材料。术后1个月以免疫组织化学染色法定量分析新生骨中的骨钙蛋白和骨桥蛋白，结果显示：自体骨/prp-100中骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达最高，并伴有新形成骨量的增加，而自体骨/prp-150组中骨桥蛋白的表达低于单纯自体骨移植组。而且剩余骨移植颗粒的量也要高于其他组别。作者认为，自体骨/PRP联合应用促进骨的愈合需要合适的比例，PRP含量超过此比例时反而起到相反的作用。

目前，PRP促进组织再生的最佳血小板浓度尚不清楚，但可以明确PRP促进组织再生需要一个最佳的血小板浓缩度，低于或高于这个比例都不会得到很好的临床效果。

2.2 PRP促组织再生作用的持续时间

PRP一经激活,超过95%的生长因子在1 h内释放出来,首次释放之后PRP中的血小板可以继续合成和释放更多的生长因子,一般在7 d后血小板失效[4]。所以PRP在创伤愈合的早期效果比较明显。PRP激活后应用于创面,随着生长因子的大量释放,组织细胞开始一系列的增殖和分化。He L[17]等研究中将PRP和PRF在诱导成骨细胞的增殖和分化做对比时也证实这一观点：PRP在术后第1天表达TGF-1 和PDGF-AB因子的数量达到最高峰值，而之后表达明显下降；PRF则在术后第7天和第14天分别表达最高数量的PDGF-αβ和TGF-1，由PRF诱导的细胞在第14天达到矿化峰值。

2.3 PRP制取的方法

制备PRP的方法较多，使用不同的制备系统，在不同的离心次数、离心力和离心时间所制备出的PRP中，血小板的体积分数以及各种生长因子的量和活性各不相同。Weibrich等[18]比较了两种不同的PRP制取系统: 浓缩血小板采集系统 (PCCS，platelet concentration collection system)与 Curasan(eurasan PRP kit)系统，发现PCCS系统产生的血小板数更多，TGF-β与IGF-I的浓度更高。Jo CH等[19]对制取PRP过程中的离心力、时间做了研究，证明首次离心采用900 g离心力离心5 min，再次离心采用1500 g离心力离心15 min获得的血小板的成活率最高。此外，由于每个个体内血小板数量的不同，相同的血小板含有的生长因子的水平也不相同。因此，对于获得最佳使用效果PRP的制备是否需要个性化，还需要进一步的研究。

2.4 凝血酶的影响

凝血酶常用于激活富血小板血浆，有利于生长因子的释放。用于PRP激活的凝血酶主要有两种来源：一种为自体获取的人凝血酶，一种为异种来源的凝血酶，主要为牛凝血酶。Su等[20]分别用人凝血酶和牛凝血酶来制备PRP凝胶，发现用人凝血酶制成的PRP其PDGF和TGF浓度高于用牛凝血酶制成的。但对于牛凝血酶的不良反应在临床中亦有报道：如过敏性休克[21]，增加牛海绵状脑病传播的危险[22]，使机体对凝血因子V、XI产生抗体，导致体内凝血系统紊乱[23]。

Mazzucco L等[24]指出PRP中不加入凝血酶可减少生长因子的丢失，延长PRP的作用时间。Rodrigues SV等[25]在牙周骨内缺损治疗研究中，未加凝血酶的PRP无论是否与牛骨联合应用，术后患者的牙周袋探诊深度及附着水平均有明显改善。因此，对于在PRP中是否加入凝血酶还存在较大争议。

2.5 PRP载体材料的影响

在口腔骨组织工程中，骨移植材料包括自体骨，同种异体骨和异种骨移植。其中，自体骨通过骨引导和成骨来促进愈合，异体骨是通过骨诱导性来促进骨形成，异种骨则是通过骨引导性来促进骨愈合。PRP和各种骨移植材料联合应用于组织再生，不同的载体材料所起的作用也有所不同。Zhang等[9]动物实验中，分别以coral(多孔珊瑚)/PRP/MSC、coral/PRP、coral/MSCs作为移植材料应用于骨缺损区，术后7～14 d检测碱基磷酸酶的活性，4～8周观察骨的形成。结果发现，coral/PRP/MSC组碱基磷酸酶的活性最高，相对于其他两组其差异具有显著性意义，并有更多的新骨形成，而coral/PRP 组中未见软骨或新骨的形成;在上颌窦充填、窦底提升时，PRP 与BMSCs 的混合物较单纯松质骨颗粒或单纯PRP 更能促进骨再生[26]；动物实验中，自体骨混合PRP骨髓或间充质细胞可以促进骨的愈合，但是自体骨和PRP单独应用，其增强骨再生效果似乎不如自体骨髓或间充质细胞的好[27]。这些均表明BMSC为PRP的良好的载体材料，PRP在BMSC存在时能够发挥更好的促进作用。而魏红等[28]研究中就PRP、Bio-Oss、PRP复合骨移植材料Bio-Oss对大鼠牙周创伤模型中牙周组织再生的作用进行比较时发现，PRP-Bio-Oss材料尽管比单独使用Bio - Oss有较多的骨形成,但未见明显促进作用,缺损处的大部分空间都被骨粉占据，作为支架材料的Bio-Oss并未起到促进骨形成的作用,相反制约了大鼠牙槽骨的再生。认为这可能是由于Bio-Oss降解速度较慢,在大鼠自体牙槽骨形成过程中,占据了自体骨形成的空间,阻碍了骨的形成。因此，PRP的促进作用与载体材料也有一定的关系。

除上述PRP自身的因素外，实验设计也是很重要的影响因素。动物实验与临床实验中，不同实验对象之间个体的差异，临床中病人自身的术后维护情况，随访期长短的不同等都会影响实验的结果。

3 结 语

由于血小板激活并释放生长因子是一个复杂的过程，血小板数量的增加并不能立即使所有生长因子浓度相应升高，PRP体内最佳作用浓度、制取设备、凝血酶、各生长因子释放的顺序及相互作用等因素均制约着PRP作用的发挥。因此，统一各种非生物性因素，在最佳的体内作用浓度下，并联合应用合理的载体材料,PRP促进组织再生的作用是肯定的。具体的PRP促进组织再生的临床效果仍需要更深入的研究及大量的证据来证明。

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