种子超干贮存研究进展

陈志宏,李晓芳,贠旭疆,高洪文

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193； 2.全国畜牧总站，北京 100125)

植物种质资源的有效保护需要原生境和非原生境保护相结合。原生境保护保存了种质资源在继续进化中所增加的多样性；而非原生境保护的目的在于保持种质资源的遗传稳定性(genetic stability)，采用的保存技术要最大限度地减少突变、选择、随机漂移和遗传混杂的可能性。大多数植物的种子在低温和低含水量下能够长期而稳定地保存，因而种子库成为主要的非原生境保存方式[1]。在种子贮藏过程中贮藏温度和种子含水量是种子活力和生活力保持的关键因素，因控制温度比控制水分容易而且可靠、安全，因而种子贮藏都趋向低温和超低温的方向发展。国际植物遗传资源委员会曾推荐(5±2)%的含水量和-18 ℃低温贮藏条件作为种质资源长期保存的理想条件，世界各国都在普遍使用。世界上已收集到的610万份植物种质资源中，约90%是以种子形式保存于上千座低温种质库中[2]。但由于低温种质库耗资巨大，技术要求高，电源要有保障，常年运转费用昂贵，这些条件限制低温种质库的建设和运行。于是人们希望进一步寻找更好的种子贮存方法，既节约能源，减少经费开支，又可获得同样的贮存效果。在此背景下，联合国FAO/IPGRI于20世纪80年代后期发起并资助全球范围的种子超干贮存研究，先后选择英国Reading大学种子实验室和中国科学院植物研究所开展这方面的系统研究。经过大量的研究证实，超干贮存在种质资源保护上是可行的。现将国内外的研究作一简要阐述。

1 超干贮存种子的含水量安全下限

种子超干贮存是20世纪80年代末期种子学和植物保护生物学领域兴起的研究热点。它以适当的干燥技术将种子含水量降低到5%以下，即采取低含水量种子密闭贮藏在常温条件下的方法，以达到部分或全部取替低温库的目的。Ellis[3]的早期研究发现，某些耐干藏的种子对含水量(moisture content，MC)与温度的效应之间存在一定程度上的互补关系，即通过降低MC，在某种程度上可达到降低贮藏温度的效果。40多年前，Nutile[4]的研究表明，正常型种子低于1%的种子含水量时仍能存活。近年来Hong等[5]的研究表明，超干贮存的萝卜(Raphanussativus)、落花生(Arachishypogaea)、洋葱(Alliumcepa)、油料种子在20 ℃贮藏10年仍然保持活力。

超干能提高种子的耐藏稳定性，但并不意味着含水量越低越好[6]。研究表明[7]，当种子含水量降低到某一定值时，种子活力下降。过度超干对种子寿命无益，甚至促使其劣变。大量的研究表明，不同种、品种的种子最佳贮藏含水量的差异很大，从2%到6%[8]。这可能跟种子内的化学物质有关系，疏水物质含量越高，相等条件下的种子最适含水量越低，种子耐脱水性越强。如油菜(Brassicacampestris)种子含水量降至1.5%以下，种子仍保持活力，且贮藏寿命延长[9]；如Ellis等[9]研究认为，最适含水量油菜为2.8%，芥菜(Brassicajunceavar.gracilis)为3.8%，花生为2.0%等。淀粉类种子耐脱水能力在种间差异很大，如高粱(Sorghumvulgare)、大麦(Hordeumvulgare)、小麦(Triticumaestivum)种子耐脱水能力较强，而水稻(Oryzasativa)种子耐脱水能力差。但Medeiros等[10]研究结果表明，种子寿命和含油量不存在正相关。Lima和Ellis[11]对15个不同植物种子的研究表明，种子寿命与种子含水量不存在线性关系。Demir和Ellis[12]认为种子的寿命可能跟饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的组成或比例有关。但目前种子的最适含水量的确定仍然没有令人信服的方法，国际上对种子贮藏临界含水量值的确定仍存在争议。如Ellis等[13]认为种子在相对湿度10%～11%下达到平衡时的含水量为最适含水量，它适合于种子在室温下的贮藏，而且它不随贮藏温度的降低而增加(至少在35～65 ℃范围内)。而Vertucci和Roos[14]认为温度影响着种子最适含水量水平，如在高温(如65 ℃)条件下有较好的活力保持能力的含水量水平，并不等于在室温下此含水量水平的种子也有如此高的活力保持能力，种子最适含水量在温度为22～40 ℃时随温度的升高而降低，而在40～65 ℃时，其值基本恒定。吴晓亮[15]对在不同地区贮藏的水稻种子的最适含水量的研究表明，种子贮藏的最适含水量与贮藏温度有关，即随贮藏温度和≥0 ℃积温的下降而上升。胡承莲和胡小荣[16]以硅胶为干燥剂，研究不同含水量水稻种子的最适含水量对种子生活力和活力的影响，结果表明贮藏在45 ℃的稻和粳稻种子的最适含水量为4%～5%，贮藏在室温下的最佳含水量为5%～7%。朱诚等[17]把不同含水量的洋葱种子贮藏在35 ℃、室温和5 ℃条件下1～3年，发现适度超干处理能延长种子的贮藏寿命，种子含水量低于2.2%不利于种子贮存，此外种子贮藏的含水量随温度而变化，35 ℃时为3.4%，室温时为3.4%～3.5%。

2 种子的耐脱水性机理研究

不同种子耐干性差异很大，淀粉类种子很难干燥到含水量为5%以下水平，而油料种子易干燥至该水平以下，甚至在含水量低于1%时，种子活力不受影响，且耐贮性大为增强。种子忍耐低含水量的程度，取决于种子的耐脱水性。耐脱水性是种子在发育过程中获得的一种综合特性，一旦种子萌发，耐脱水性就消失。Vertucci和Roos[14]指出种子耐脱水性可能是一种数量性状，与种子内蛋白质、脂肪、碳水化合物的积累成正相关。耐脱水性的形成也与植物种类和发育时期密切相关，正常型种子发育初期不耐脱水，在发育中后期获得脱水耐性，而在萌发开始后却失去耐脱水性；顽拗型种子的发育缺乏成熟脱水阶段，种子一直对脱水敏感。Roberts和Ellis[18]等认为，低于和高于最适含水量种子寿命对含水量的反应是由于水分在种子中的状态不同而引起的。种子耐脱水性机理一直是国内外种子生理科学家研究的重要内容，近几年来在这一领域里已有了新的进展。

2.1蛋白质与种子耐脱水性 在正常型种子中，耐脱水性获得的时间大约在种子发育过程的1/3至1/2时期[19-20]。当花生种子授粉后40天(DAP)胚轴耐脱水时，干物质的积累为最后干物质量的50%，贮藏蛋白的含量为最后贮藏蛋白含量的39%[21]。可见贮藏蛋白含量与耐脱水性存在一定关系。转基因试验直接证明了LEA 蛋白的作用，将大麦LEA基因HVA1转入水稻，HVA1蛋白在转基因水稻中表达，同时与水分亏缺和盐胁迫的抗性能力直接相关[22]。Blackman等[23]指出，胚或胚轴在获得耐脱水性时已经积累了一定量的包括贮藏蛋白在内的热稳定蛋白，已有研究表明小分子量的热稳定蛋白与植物耐干性密切相关，它们积累至高浓度的过程与细胞耐脱水性的获得相一致，其中LEA蛋白和小分子热激蛋白(HSPs)等由于具有高的热稳定性和亲和力，而被认为在种子脱水时起重要作用[13-15,23-27]。

LEA蛋白最早在棉花的胚中发现，是在正常种子发育后期，伴随脱水干燥过程形成的一类低分子量蛋白(约10～30 kD)，具有高亲水性和热稳定性，能够在水分亏缺时保护膜的结构。许多试验证明正常型种子如玉米(Zeamays)[28]、花生[29]、小麦[30]耐脱水能力的获得与LEA蛋白表达有关。朱诚等[31]认为水稻种子耐脱水性差异与水稻种子的热稳定性蛋白有关；吴晓亮[15]的研究表明，适度干燥的豌豆(Pisumsatium)种子，虽然没有产生新的热稳定蛋白，但其热稳定蛋白含量明显增加，这与种子的活力高低正好一致，表明热稳定蛋白含量的提高可以增加种子的活力。

一般认为LEA蛋白能阻止大分子的凝结，保护细胞结构的完整性，稳定膜系统，提高回水修复能力，减少植物组织因干燥而造成的细胞损伤。LEA蛋白的结构中有显著高含量的极性残基，它们能不同程度的螯合离子与替换水的氢键[32]。因此认为，一些LEA蛋白具有包被作用，可以将细胞内的生物大分子通过内聚水层包被起来，即所谓的优先水合机制[33]。LEA蛋白由于具有热稳定性和高亲水性，可能作为脱水保护剂和替代水而发挥作用。棉花种子内的LEA-D11起分子伴侣和亲和性溶质的作用，稳定和保护蛋白质的结构及功能[34]。但也有报道指出LEA蛋白可能与脱水耐性的获得无关，如英国栎(Quercusrobur)种子等植物组织，在有水环境或温度胁迫时也检测到了LEA转录[35]；3个不同LEA基因在烟草(Nicotianatabacum)中的表达并不表现出耐脱水性[36]；LEA蛋白的合成与种子耐脱水过程的获得也不完全一致[37]，在大豆(Glycinemax)[38]胚轴获得耐脱水性之前已有脱水素的合成。因此对于植物组织的耐脱水性，LEA蛋白虽然可能是一个必要的组成部分但还不能提供充分的保护作用。

花生球蛋白(主要的贮藏蛋白)在发育过程中不耐热，但缓慢干燥可增加其热稳定性，而成熟花生胚特有的低分子量热稳定蛋白可能参与这个转录后修饰过程[31]。有试验[33]证明，耐热应激蛋白的结合可使那些本身并不耐热的蛋白质获得耐热能力。

2.2抗氧化系统与种子耐脱水性 目前，多数学者认为种子劣变的原因是脂质过氧化，脂质过氧化始于自由基的产生[39]。在正常生理状态下，自由基的产生和消除处于平衡状态，只有当种子处在不利的物理和化学因素下，产生的自由基得不到消除，或者内源性自由基的产生和消除失去了正常平衡时，细胞内过多的自由基有较强的氧化作用，能引发膜上不饱和脂肪酸产生过氧化反应，引起蛋白质、DNA和RNA等生物大分子的损伤[40-41]，对机体造成损伤。与此同时，生物体内还存在一系列的自由基清除剂，它们可以清除细胞内过量的活性氧，维持活性氧代谢平衡，保护细胞膜不受自由基的伤害[42]。早期的研究表明，在超干种子中，极度脱水导致细胞膜外围的水膜连续界面被破坏，使膜上敏感位点的大分子暴露而易受活性氧的伤害，加速了膜脂过氧化的连锁反应，最终导致种子细胞的衰老和种子活力的下降。但是，后来的研究表明，大多数的植物种子能干燥到5%以下，特别是油料种子的含水量降低到1%以下仍能存活[43]。Zhu和Chen[44]对花生种子的超干保存研究表明，适度干燥直接或间接地抑制脂质过氧化，当种子含水量低于0.9%时，丙二醛(MDA)的含量会略高于对照，说明过度干燥一定程度上促进脂质过氧化。MDA是种子在贮藏过程中随着劣变的发生逐渐积累的有毒的脂质过氧化产物，其含量的增加可表示种子脂质氧化的程度。挥发性醛类物质释放量说明种子脂质经过各种途径氧化的综合结果，可以反映种子主要因脂质氧化导致的劣变程度。

在脱水过程中，抗氧化系统以酶促或非酶促保护系统来防止、忍耐或修复自由基的攻击。酶促保护系统主要包括：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、愈创木酚过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等；非酶促保护系统主要指抗坏血酸(AsA)、 α-生育酚(VE)、还原型谷胱甘肽(GSH)、 β-胡萝卜素、抗氧化剂维生素C(VC)等，还包括次生代谢物质(多酚、单宁、黄酮类物质等)和一些渗透调节物质(脯氨酸、甜菜碱、甘露醇等)，它们通过多条途径直接或间接地猝灭活性氧。因此，抗氧化系统是脱水耐性的一个重要组成部分。程红焱[45]测定不同含水量油菜种子内的VE、GSH含量的结果表明，VC和GSH的含量与种子脱水程度无关，在超干贮存过程中二者含量以相同的幅度下降，而超干种子中的VE含量无论是贮藏前后都比未超干种子高。洋葱超干种子经一定时间人工老化后，还原肽VC、VE含量明显高于未超干种子，而且在吸胀过程仍然保持较高水平[46]。表明超干贮存的种子含有高水平的抗氧化剂和自由基螯合剂，在种子进一步劣变的过程中具有高的清除活性氧的潜在能力，从而延缓种子老化，提高贮藏寿命。

正常型种子可在成熟过程中积累自由基清除剂，如花生种子的含水量从45%降至6%时，过氧化物酶(POD)和MDA只稍微增加，而保护酶系统的活性显著增加，并维持在较高水平[47]；生理成熟的玉米种子，其含水量约为48%，在脱水过程中种子的发芽率和活力指数逐渐增加，SOD活性在种子脱水初期上升，然后下降，MDA和脂质氢化物(LOOH)含量随着水分丧失有所增加[48]。而顽拗型种子如荔枝(Litchichinensis)、黄皮(Clausenalansium)和枇杷(Eriobotryajaponica)种子含水量减少至30%～35%时，MDA含量增加，SOD和POD活性逐渐减弱，抗氧化系统明显受到损害[49]；研究表明，用AsA和甘露醇预处理黄皮种子24 h后，于室温自然脱水5 d，种子的萌发率及活力指数均提高，MDA和LOOH减少，SOD活性上升；正常型种子玉米和大豆胚的生育酚含量大约是顽拗型种子英国栎的10倍[48]。由此可见，膜脂过氧化作用是顽拗型种子脱水敏感性的重要因素之一。

2.3糖与种子耐脱水性 研究表明[50]，可溶性碳水化合物的积累是种子在发育和成熟过程中形成脱水耐性的原因之一，蔗糖、低聚糖和非还原糖与超干种子的耐干性有关[51]，寡糖等非还原性糖的合成有利于种子贮藏物质以无毒性和非还原性形式积累[52]，禾谷类种子胚中棉子糖的积累和脱水耐性的形成正相关[53],在种子脱水过程中，糖取代水分子保护膜结构，使细胞膜免受脱水的伤害[52，54]。糖与种子脱水耐性的关系主要来自于寡糖的累积及消失与种子脱水耐性的消长模式一致[55]。较有力的证据来自转基因植物[56]，将编码海藻糖合成酶的基因导入到烟草中，烟草内海藻的含量明显高于对照，经同等条件脱水及复水后，对照幼苗严重损伤死亡，而转基因幼苗则完全恢复张度并开始生长。模拟试验显示，蔗糖是一种非常有效的膜保护物质，其羟基可通过与膜脂极性头部形成氢键而在种子脱水过程中取代水分子，还可以使细胞质在脱水时玻璃化而保持稳定[57]。Wang等[58]研究表明，超干种子中还原糖/非还原糖低于高含水量种子，积累的蔗糖、水苏糖含量与超干种子的耐干力有关。玉米种子中不含水苏糖，这可能是玉米种子较其他种子耐干力差的原因之一。

2.4细胞膜系统与种子耐脱水性 细胞膜是细胞与外界交流的屏障，其流动性对与膜相关的许多功能活动的调节具有重要意义，它既能调节细胞物质交流和运输，又能影响酶活性，细胞膜的完整性是种子活力的基础，若膜受到损伤，细胞器发生畸变与解体，各种大分子酶遭到破坏将导致种子活力下降。膜结构的稳定性表现在膜的选择透性上，种子活力丧失是由细胞膜系统的损伤引起的，膜功能的减弱使细胞内大量物质外渗，种子活力下降过程中细胞大量的电解质外渗是细胞膜受损害的一个主要标志[59-62]。油菜、花生、榆树(Ulmuspumila)、洋葱等[63-66]超干种子若直接浸种会引起胞内大量物质外渗，而严格回水处理后胞内电解质的外渗量即降低，表明回水对超干种子膜的物理修补有很好的效果，超干本身并不会对膜产生伤害。经过一段时间贮藏后，超干种子胞内电解质的外渗量比未经超干的种子明显低，这表明在贮藏过程中超干种子膜的选择透性比未超干种子保持的完善。Wang等[58]研究表明，榆树种子不耐超干贮存，当种子含水量非常低时，膜的流动性减弱，维持膜完整性的能力降低了。

自由基伤害应是脱水敏感性发生的首要因素，而寡糖与热稳定蛋白的保护作用都是以防御自由基伤害为前提的[67]。至于三者之间的联系还有待于进一步研究。

3 贮藏种子遗传完整性变化研究

种质安全保存的最终目的是要保存其固有的遗传性状能代代相传，不能在超干燥或贮存的过程中丢失，因此贮存种子不仅要保持种子高的发芽能力而且还要保持其遗传稳定性，所以贮藏种子的遗传稳定性进行检测对评价种子贮存的效果就显得十分重要。

3.1利用形态学特征研究种质的遗传完整性 有关种质遗传变化的检测，早期主要是通过观察检测农艺性状数据，即植物的外部特征，如幼苗芽鞘颜色、株形、株高、穗长、粒色、千粒重等。Chauhan和Banerjee[68]分析了老化后大豆种子和老化大麦种子，发现2种作物经老化处理后表型变异差异显著增加，老化可使基因型和环境的互作增强。此种形态标记简单直观，长期以来作物种质资源鉴定及育种材料的选择通常都是根据形态标记来进行的。但该方法缺点是形态标记数少、多态性差、易受环境条件影响。

3.2利用细胞学标记研究种质的遗传完整性 在种质遗传完整性研究中最常用的细胞学标记方法是根尖染色体畸变观察法。Navashin[69]早在20世纪30-40年代就已开始研究在贮藏过程中种子衰老与染色体畸变的关系。采用根尖染色体畸变观察法进行研究后，发现随贮存年限增加，种子衰老程度加剧，种子生活力下降，染色体畸变率与发芽率呈负相关。

3.3利用生理生化指标研究种质的遗传完整性 Parzies等[70]研究了贮藏10年、40年和72年以及一直在生产上种植的2份大麦地方品种的同工酶谱带，指出随贮存时间的增加，种质的遗传多样性、平均每位点的等位基因数和多态位点百分率都显著下降。张晗等[71]用醇溶蛋白电泳检测了大麦地方品种不同老化水平种子的遗传完整性，发现随着种子生活力的下降，其群体中的4种biotype的频率发生了变化，当发芽率从95%降到34%时，其中1种biotype出现了消失，而有1种biotype频率从83%上升至95%。

3.4利用分子标记研究种质的遗传完整性 种子在贮存中，老化造成的基因突变、发芽率降低对种子群体遗传型的选择，导致种质在DNA水平的变化，从而使种质丧失原有的遗传完整性。胡小荣[72]采用对小麦贮藏种子的遗传稳定性的研究表明，小麦种子干燥与超干燥保存不会引起种子幼苗在AFLP和SSR分子水平的遗传变异。与SSR相比AFLP更适合于检测贮存种子的遗传变异。国际小麦玉米改良中心(CIMMYT)[73]采用SSR标记对过去收集保存的玉米种质资源与最近收集的种质群体进行了比较，发现它们在多态性上存在较大差异。张晗等[71]用SSR分子标记技术分析老化玉米种子的遗传结构的变化，随老化程度的加深，种质的等位基因数量、有效等位基因数量和基因的多样性都有显著下降。Jing和Tao[74]的研究发现榆树超干种子在35 ℃人工老化条件下，能有效抑制其伴随时间推移而产生的生活力下降和染色体变异，种子保存寿命明显延长。Rao等[75]报道当莴苣(Lactucasativa)种子在含水量为3.3%保存时，染色体畸变率要比8%时的高。超低水分种子丧失一定生活力的同时会积累较多的变异，但这种变异会在植物生长过程中自行修复消失[76]。李毅[77]采用RAPD对霸王(Zygophyllumxanthoxylum)、黄花补血草(Limoniumaureum)和蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)3种荒漠植物种子遗传稳定性的研究发现，超干保存不会引起种子的遗传变异。胡小荣[72]对超干燥种子根尖细胞染色体的畸变率进行了研究，认为种子生活力下降到47%时，畸变率明显升高，而超干燥本身并未引起畸变率升高。AFLP和SSR分子技术研究表明，小麦种子干燥与超干燥保存不会引起种子幼苗在AFLP和SSR水平上的遗传变异。AFLP与SSR相比，AFLP更适合于检测贮存种子的遗传变异。

综上所述，种子超干贮存技术作为一项节能、能有效延长种子寿命的新技术，在近20年来，这方面的研究取得很大进展，同时也出现一系列有争议和尚待深入研究的问题，如种子超干贮存的最佳含水量，超干贮存的生理生化机制，超干贮存中遗传完整性的变化。因此，必须对种子超干贮存深入研究，以使超干贮存技术在种质资源保护方面得到广泛应用。

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