花椰菜游离小孢子培养研究进展

李念祖，汤青林，王志敏，宋明

（西南大学园艺园林学院；南方山地园艺学教育部重点实验室；重庆市蔬菜学重点实验室，重庆，400715）

花椰菜游离小孢子培养研究进展

李念祖，汤青林，王志敏，宋明

（西南大学园艺园林学院；南方山地园艺学教育部重点实验室；重庆市蔬菜学重点实验室，重庆，400715）

分析了影响花椰菜游离小孢子培养的主要因素（材料基因型、小孢子发育时期、预处理和预培养、培养基成分、培养技术），并对胚状体发生与植株再生、DH纯系获得等的研究情况进行了阐述，展望了游离小孢子培养技术发展前景。

花椰菜；游离小孢子；培养条件

花椰菜 （Brassica oleraceaL.var.botrytis）又称花菜、菜花、椰菜花，是十字花科芸薹属甘蓝种以花球为主要产品的一个变种。它富含多种维生素和微量元素，具有较高的食用价值，在我国蔬菜生产中占有重要地位。常规育种技术纯化种质资源效率低、周期长，而游离小孢子培养（isolated microspore culture，IMC）技术又叫花粉培养（pollen culture），是指直接从花蕾或花药中游离出合适的小孢子群体，在液体培养基中诱导形成小孢子胚和再生植株的过程。该技术是在单细胞水平上获得双单倍体（doubled haploid，DH）纯系的方法，主要包括小孢子胚的诱导、再生植株和DH系形成3个过程。游离小孢子培养技术是一种有效的生物技术育种方法，可在1～2 a内获得优良自交系和自交不亲和系，用于育种可缩短育种年限，从而提高育种效率，与常规多代自交获得纯系相比，具有周期短、效率高、纯系稳定等特点。

1 小孢子胚的诱导

1.1 基因型的选择

基因型是影响小孢子胚胎发生率的关键因素。不同基因型材料在相同试验条件下培养，胚状体产量不同。方淑桂等[1]以80份早中熟花椰菜栽培种为材料进行小孢子培养时，有20份材料诱导出胚状体，诱导率为25%；基因型不同，产胚量差异也较大，在能出胚的基因型中，产胚量最高每蕾平均36.0个，最低的每蕾只有0.2个，相差182.5倍。赵前程等[2]的186个试材中，有55个材料得到了小孢子胚，培养反应率为29.6%。由此可见，小孢子胚胎发生能力同其他遗传性状一样，是受基因调控的遗传特性，对较难诱导的基因型，可通过与易诱导材料杂交后再培养，提高胚诱导率。

1.2 小孢子的发育时期

花蕾大小，即小孢子所处的发育时期，是影响培养效果的关键因素之一。植株发育状态直接影响小孢子的生理生化特性和小孢子的发育方向，通常认为小孢子培养的最佳时期是单核晚期至双核早期。赵前程等[2]在试验中以单核早期、单核靠边期、双核期和三核期的小孢子进行培养，研究不同发育阶段对小孢子胚状体发生的影响，结果表明，单核靠边期到双核期的小孢子培养出胚率高，而在三核期和单核早期进行花椰菜小孢子培养不能获得胚状体。这与方淑桂等[1]的研究结果一致，盛花前期培养的小孢子产胚量最高，比其他时期培养的高20%以上，差异达极显著水平。

1.3 预处理和预培养

为了提高花粉培养的效率，通常对试验材料进行预处理。预处理包括高温、离心、低温、射线、甘露醇或预培养等方式，其目的就是从生理生化上改变细胞生理状态、分裂方式和发育途径，有效地抑制小孢子的配子体发育途径，提高单核小孢子核对称分裂的频率。顾宏辉等[3]的研究结果表明，不同的热激温度与热激时间组合对花椰菜小孢子培养胚产量有显著的影响，32℃热激处理24 h，小孢子胚产量显著高于其他组合，这与Dias[4]发表的结论相一致，而Duijs等[5]研究却发现30℃处理48 h最合适，方淑桂等[1]研究认为33℃处理48 h最适宜。

1.4 培养基成分

①蔗糖的浓度 蔗糖不仅作为碳源为游离小孢子提供能量并且还是小孢子的渗透调节剂，其浓度大小对小孢子存活及是否发育成胚具有很大的影响。张晓芬等[6]在研究花椰菜游离小孢子培养时，比较了含10%，13%和16%蔗糖的培养基的出胚率，结果显示含13%蔗糖的NLN培养基胚胎发生率最高。

②激素的影响 在培养基中添加6-BA，NAA对游离小孢子培养的影响已经有很多研究。在赵前程等[7]的研究中，当1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA组合使用时，愈伤组织发育速度较快，愈伤组织质量最好，能够进一步诱导获得胚芽。而6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L的激素组合最适宜花椰菜胚胎愈伤组织分化形成再生植株，愈伤组织分化率达到100%，平均每块愈伤组织的胚芽分化数量达到6.52个。

③活性炭的影响 孙丹等[8]研究表明，在培养基中添加0.10 mg/L活性炭能增加大多数品种的胚产量。原因可能是适量的活性炭可以吸附一些由于胚胎滋生产生的代谢物质，从而促进胚胎发育。赵前程等[7]对花椰菜小孢子的研究表明，在胚胎转移到脱分化培养基的初期，添加100 mg/L的活性炭可以减少胚胎褐化、死亡，这个结果与姜凤英等[9]的研究结果相一致。试验中还发现，活性炭添加在固体培养基表面比混合在培养基中效果更好。韩阳等[10]研究发现，高浓度的活性炭对小孢子胚的发生表现出抑制作用。原因可能在于活动炭的吸附作用无选择性，当其浓度超过适宜浓度后，在吸附培养基中有害物质的同时，也吸附了生长调节剂、铁盐、维生素等与胚生长和分化密切相关的有益物质。

1.5 接种密度的影响

接种密度是影响小孢子培养能否成功的一个至关重要的因素，也是在试验操作中常常被忽略的问题。每1 mL培养基接种1.5～2个花蕾的小孢子较适宜，多数研究者采用每1 mL培养基接种2个花蕾的小孢子，若每1 mL培养基接种2个以上花蕾，其产胚率下降，甚至不能形成胚状体[11]。因为小孢子浓度过高时，会消耗大量的营养物质，并且释放许多有害物质，影响胚的发育。但小孢子发育需要群体效应，浓度过低同样不利于小孢子胚胎的生长发育。赵前程等[7]对花椰菜小孢子培养时，小孢子培养密度为1×105～2×105个/mL时，出胚率较高。因为适宜培养的花蕾数目，可能与操作方法有关，所以应该利用血球计数板观测并计算出较为准确的小孢子密度。

1.6 更换培养液

在小孢子培养初期更新培养液能够提高胚状体产量，从而减少愈伤状胚的形成，但更换培养液需要重新离心，对正在膨大和分裂的小孢子有一定的损害。此外培养初期将高糖浓度换成低糖浓度能够显著提高小孢子培养的产胚率。另外，加液培养也能提高胚状体诱导频率，因为加液培养能够稀释细胞毒素，同时还能补充营养物质。顾宏辉等[3]对冬性花椰菜进行小孢子培养，结果表明，更换培养液，即在NLN-13起始培养液下培养24 h后，换成新鲜的NLN-13培养液，或将NLN-17换成NLN-10，均能明显改善胚体形状，减少愈伤状胚的数量，从而提高正常胚体率。方淑佳等[1]对花椰菜进行小孢子培养时，为了维持小孢子的活力，起始培养用含16%蔗糖的培养液，3 d后加入等量的含10%蔗糖的培养液，使蔗糖质量分数稀释到13%，出胚率与13%蔗糖的培养液对照相比增长205.08%。

1.7 振荡培养

一般液体培养基的营养物质容易被小孢子吸收，但由于透气不良，会有褐色胚产生。小孢子在培养14 d后，由静置培养改为60 r/min振荡培养，可以改善液体培养基的通气性，使子叶胚率大大提高，胚也更健壮，提高了胚发育的同步性和胚质量，促使了胚在成苗培养基上直接成苗[9]。

2 胚状体的发生及植株再生

小孢子分离后，经过高温热击和常温培养，约30 d可得到子叶期胚状体；胚状体经过诱导、萌发和继代培养，5～6周可获得再生植株；然后进入继代（增殖）阶段，待室外条件适宜再生植株移栽时，室外炼苗约1周后，将再生植株移入穴盘中。顾宏辉等[12]试验结果表明，不同花椰菜品种对小孢子培养的反应不同。胚状体产量最高的品种平均每花蕾胚产量达45.6个，最高每花蕾胚产量达到112个，而早花45 d小孢子未能诱导出胚。胚状体对萌发培养基的反应也不尽相同。胚状体生育期、数量、大小均对萌发率有影响。再生植株的生成还受到培养基水分、通气、光照、温度的影响。刘凡等[13]研究发现，成熟的小孢子胚在NLN（13%）液体培养基中停留时间的长短对以后的胚培养影响甚大，在液体培养基中停留14 d和21d的小孢子胚转移至MS0培养基培养56 d时成苗率分别为85%和81.6%，停留28 d和35 d的小孢子胚最终成苗率只有63.3%和42.7%。周伟军等[14]发现，胚状体转移到固体培养基后立即进行低温诱导（2℃）处理10 d，其萌发率和成苗率均显著高于无低温处理。

3 DH纯系获得

DH纯系获得包括小孢子植株的加倍和DH后代的性状鉴定等。研究发现，同一小孢子来源的个体，其性状、花期等高度一致，在遗传上是纯合的；不同小孢子来源的植株后代，其性状、花期、株高、分枝数等均有差异，出现亲和、不亲和等不同变异类型，可进行选择利用。小孢子再生株后代自交结实正常，单株种子量在2 g以上，倍性稳定，可直接用于品种选育。小孢子植株有单倍体、二倍体及多倍体等类型，植株自然加倍率为60%～70%，有利于形成DH株系，在育种中具有重要意义。如需人工加倍，主要用0.2～4.0 mg/L秋水仙碱处理单倍体植株[15]。

4 展望

经过国内外学者数10 a的研究探索，游离小孢子培养的技术已越来越完善，胚状体的诱导频率也有了显著提高，这为游离小孢子的广泛应用奠定了基础。游离小孢子培养技术可大大缩短育种年限，提高育种效率，具有单细胞单倍性、群体数量多、自然分散性好、不受体细胞干扰、便于遗传操作等优点，因此游离小孢子培养方法还可以应用于诱变和突变体筛选、基因转化等研究，通过花粉培养建立的双单倍体群体更是分子标记和基因图谱的理想材料。但是还应看到，目前花椰菜游离小孢子培养在启动机理、微观发育机制、发育途径等理论研究，以及与之相关的外界环境对游离小孢子生长的生理生化方面研究还十分欠缺，还没有建立起完善高效的再生体系。所以今后应在花椰菜游离小孢子研究中，加强基因型、微观发育调控和外界条件对花椰菜游离小孢子生长发育的研究。

[1]方淑桂，朱朝辉，曾小玲，等.花椰菜游离小孢子培养及影响因子[J].福建农业学报，2006，21（2）：138-142.

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[3]顾宏辉，唐桂香，张国庆，等.冬性花椰菜的小孢子胚诱导和植株再生研究[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（1）：34-38.

[4]Dias J S.Effect of incubation temperature regimes and culture medium on broccoli microspore culture embryogenesis [J].Euphtica,2001,119:389-394.

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[7]赵前程，佟志强，蔡荣旗，等.提高花椰菜游离小孢子胚胎植株再生率研究[J].河南农业科学，2007（7）：77-79.

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[14]周伟军，毛碧增，顾宏辉，等.秋水仙碱及热击与低温诱导对油菜小孢子胚状体成苗率的影响[J].作物学报，2002，28（3）：369-373.

[15]蒋武生，张晓伟，原玉香，等.大白菜游离小孢子培养技术研究进展及应用[J].河南农业科学，2009（9）：151-154.

Research on Dissociated Microspore's Culture ofBrassica oleraceavar.botrytis

LI Nianzu,TANG Qinglin,WANG Zhimin,SONG Ming
(College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University/Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions,Ministry of Education/Key Laboratory of Olericulture,Chongqing 400715)

This article summarized the main factors which affect the dissociated microspore's culture ofBrassica oleracea var.botrytis(the genotype of the material,the growth period of the dissociated microspores,pretreatment and pre-cultivation,the consisting of the culture,the technology),the embryoid's occurrence,the regeneration of the plant,and also the acquirement of DH lines are related.The foreground of the dissociated microspore's culture was also prospected.

Brassica oleraceavar.botrytis;Dissociated microspore;Culture condition

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.002

国家自然科学基金（31000908），中央高校基本科研业务费专项资金（XDJK2009C124），重庆市自然科学基金（2009BB1307），西南大学博士基金（SWU110009）

李念祖（1987-），男，硕士，从事蔬菜遗传育种与生物技术研究，E-mail：linianzu@sina.cn

宋明，通信作者，E-mail：swausongm@yahoo.com.cn

2011-03-30