摄食鱿鱼对乳清酸诱导大鼠脂肪肝的影响

王玉明，任兵兴，胡晓倩，张 蓓，杜 磊，王静凤，薛长湖

摄食鱿鱼对乳清酸诱导大鼠脂肪肝的影响

王玉明，任兵兴，胡晓倩，张 蓓，杜 磊，王静凤，薛长湖*

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

目的：研究摄食鱿鱼对脂肪肝大鼠脂肪代谢的影响。方法：24只大鼠分成3组，对照组喂食AIN76标准饲料，模型组饲料中添加1%乳清酸，鱿鱼组添加1%乳清酸和10%鱿鱼。饲喂10d后，分别测定大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，以及肝脏TC、TG、磷脂含量。同时测定肝脏中脂肪酸合成酶(FAS)、苹果酸酶(ME)、葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)、肉碱棕榈酰转移酶(CPT-1)和过氧化物酶体β-氧化酶系活性。结果：乳清酸可显著升高大鼠肝脏以及血清TC、TG含量，升高FAS、ME和G6PDH活性，并降低CPT-1的活性。添加鱿鱼后，显著降低了乳清酸诱导的脂肪肝模型大鼠的肝脏以及血清TC、TG水平，降低了FAS、ME、G6PDH活性并升高了过氧化物酶体β-氧化酶系活性。摄食乳清酸降低了大鼠总脂和中性固醇的排泄，摄食鱿鱼后对大鼠总脂排泄无显著影响，但降低了中性固醇的排泄。结论：摄食鱿鱼可以通过降低乳清酸诱导的脂肪肝模型大鼠的脂肪酸合成酶活性和升高过氧化物酶体β-氧化酶系活性来抑制脂肪肝大鼠肝脏脂质蓄积。

鱿鱼；脂肪肝；乳清酸；脂质代谢；酶活

鱿鱼属无脊椎海洋动物，头足纲中的枪乌贼科和鱿鱼科的统称，是海洋肉食性动物。我国传统医学认为，鱿鱼有滋阴养胃、补虚润肤的功能。鱿鱼因其风味可口、营养价值高等原因成为人们较为喜好的海产品。鱿鱼虽然胆固醇含量较高，可食部的体壁和头足中胆固醇含量可达181mg/100g，但是，已有的研究表明，摄食鱿鱼并不升高大鼠和小鼠的血脂水平[1-4]。然而前期的实验结果表明，摄食鱿鱼在降低小鼠血清脂肪浓度的同时，却使得肝脏脂肪浓度显著上升[3-4]，因此摄食鱿鱼对脂肪肝的影响亟待明确。

脂肪肝可分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，通过乳清酸诱导的脂肪肝模型属于非酒精性脂肪肝，该模型稳定可靠，适用于各种病理性脂肪肝的形成防治研究[5]。通过在大鼠饮食中添加1%乳清酸，可在3～10d诱导产生脂肪肝模型[6-8]，这一现象于1955年由Standerfer等[9]报道，并在众多研究中得到应用证实。本实验研究鱿鱼摄食对脂肪肝大鼠脂肪肝的影响，为其合理食用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿根廷鱿鱼胴体由青岛海通集团贸易有限公司提供，鱿鱼匀浆冻干后，测得鱿鱼蛋白质含量为87.0%、脂肪含量为8.51%、胆固醇含量为0.96%。

健康SD大鼠，SPF级，雄性，5周龄，体质量120～140g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2007-0001。

维生素和矿物质混合物(AIN76) 日本农工株式会社；乳清酸 日本和光纯药株式会社；丙二酰-CoA、乙酰-CoA、还原型辅酶Ⅱ、棕榈酰-CoA、L-肉碱 美国Sigma公司；胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司，其他试剂为国产生化纯。

1.2 仪器与设备

Model680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；UV-2550分光光度计 日本岛津公司；CP100MX离心机 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 饲料配制

24只大鼠按体质量随机分为正常对照组、乳清酸模型组和鱿鱼组，每组8只。

表1 动物饲料配比Table 1 Composition of feed for experimental rats %

饲料以AIN76[10]标准配方为基础配制。正常对照组和乳清酸模型组中蛋白源为20%酪蛋白，鱿鱼组添加10%蛋白含量的鱿鱼冻干粉和10%的酪蛋白，使饲料蛋白含量达20%。用玉米油将各组脂肪含量调整至10%。对照组不添加乳清酸，模型组和鱿鱼组分别添加1.0%乳清酸。饲料中除乳清酸和蔗糖外的其他成分按AIN76标准配方配制，并用蔗糖调整至100%。具体组成如表1所示。

1.3.2 动物喂养与取材

室温(22±2)℃，12h:12h明暗交替，饲料和水自由摄食，饲料每日更新并测定摄食量，体质量隔日测定，连续喂食10d。实验结束前连续3d收集粪便，冻干备用。末次喂食后，禁食不禁水12h，乙醚麻醉后，腹主动脉取全血处死；血液室温静置30min，8000r/min离心获得血清；取肝脏于-80℃保存，备用。

1.3.3 血清、肝脏、排泄物脂质浓度测定

血液室温静置30min后，7000r/min离心获得血清，按试剂盒说明书测定TC、TG、HDL-C浓度。肝脏脂质按Folch方法提取[11]，肝脏TC、TG含量由试剂盒测定，磷脂(phospholipid，PL)含量参照Bartlett等[12]方法测定。排泄物冻干后，用混合液(石油醚、乙醚、乙醇体积比1:1:1)抽提总脂并称质量，中性固醇用Folch法抽提并用试剂盒测定。

动脉粥样硬化指数(AI)按下式计算。

式中：cTC为TC含量/(mmol/L)；cHDL-C为HDL-C含量/(mmol/L)。

1.3.4 肝脏脂肪代谢相关酶活性测定

用含有0.25mol/L蔗糖和1mmol/L EDTA的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)于4℃制备肝匀浆，以700×g离心10min，去除沉淀。上清液先以10000×g离心10min，收集沉淀(此为线粒体)，按文献[13-14]方法用于肉碱棕榈酰转移酶(carnitin palmitoyl transferase，CPT)、过氧化物酶体β-氧化酶系(β过氧化物酶系)活性测定。二次离心所得上清液再以125000×g离心60min，收集上清液用于测定脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、苹果酸酶(ME)、葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PDH)活性，方法参照文献[15]，各酶活力以单位质量蛋白计。

1.3.5 数据处理方法

2 结果与分析

2.1 摄食鱿鱼对脂肪肝大鼠血清脂质浓度的影响

表2 进食鱿鱼对大鼠血清脂质浓度的影响(n=8)Table 2 Effects of dietary squid on serum lipid concentrations in rats (n=8)

图1 摄食鱿鱼对大鼠肝脏脂质代谢相关酶活性的影响(n=8)Fig.1 Effects of dietary squid on enzymes involved in hepatic lipid metabolism (n=8)

由表2可见，大鼠摄食添加乳清酸的饲料后，血清TC水平未见显著变化，但血清TG、HDL-C浓度显著升高，同时模型组动脉粥样硬化指数有下降趋势。摄食鱿鱼后，脂肪肝大鼠的血清TC、TG和HDL-C显著下降，与以往实验中[3-4]喂食小鼠后血脂代谢情况一致。模型组AI显著降低，食用鱿鱼后AI与正常对照组和模型组相比均无显著性差异。

2.2 摄食鱿鱼对脂肪肝大鼠肝脏脂质浓度的影响

表3 进食鱿鱼对大鼠肝脏脂肪代谢的影响(n=8)Table 3 Effects of dietary squid on hepatic lipid concentrations in rats (n=8)

由表3可见，模型组大鼠肝脏的TC、TG浓度相比于正常对照组升高了102%、481%(P＜0.01，P＜0.01)，显示乳清酸大鼠脂肪肝模型造模成功。摄食鱿鱼的大鼠肝脏TC、TG浓度分别较模型组降低了87.4%和46%(P＜0.05，P＜0.05)，表明摄食鱿鱼可以显著抑制脂肪肝大鼠肝脏中性脂质的蓄积。摄食鱿鱼对大鼠肝脏磷脂水平无显著性影响。

2.3 摄食鱿鱼对脂肪肝大鼠肝脏脂质代谢相关酶活性的影响

由图1可见，添加乳清酸显著升高了脂肪酸合成相关酶FAS、ME和G6PDH 的活性，与正常对照组相比，分别升高了38.5%、50.2%和43.6%。另外，摄食乳清酸后，大鼠肝脏脂肪酸β氧化关键酶CPT-1的活性降低了61.6%，但过氧化物酶体β氧化酶系无显著变化。由此可知，摄食乳清酸显著促进了脂肪酸的合成并降低了脂肪酸的分解。摄食鱿鱼后，与乳清酸模型组相比，大鼠肝脏脂肪酸合成相关酶FAS、ME和G6PDH 的活性，分别降低了65.2%、77.9%和53.8%，并且相对于正常对照组也下降显著。摄食鱿鱼对乳清酸模型组的CPT-1活性无显著影响，但显著升高了过氧化物酶体β氧化酶系的活性。

2.4 摄食鱿鱼对脂肪肝大鼠粪便中总脂肪和中性固醇的影响

由表4可见，摄食乳清酸降低了大鼠总脂和中性固醇的排泄，而相对于模型组摄食鱿鱼后大鼠总脂排泄虽无显著变化，但是中性固醇的排泄却显著降低。

表4 进食鱿鱼对大鼠粪便中总脂和中性固醇的影响(n=8)Table 4 Effects of dietary squid on fecal lipid and neutral steroid excretion in rats (n=8)

3 讨 论

非酒精性脂肪肝是肝脏脂肪代谢异常引起肝脏内甘油三酯蓄积过多的病理状态。非酒精性脂肪肝如果不能得到有效的控制将演变为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至是肝癌。现阶段，非酒精性脂肪肝动物模型一般有两种：一种是特殊种系动物的先天遗传性脂肪肝模型，这类造模方法由于涉及基因敲除等技术，成本较高；另一类是利用饮食或者药物诱发形成的模型，该方法操作相对简便，重复性较好，故得以广泛推广。大鼠食用添加1%乳清酸的饲料10d后，大鼠肝脏TC和TG水平显著升高，形成脂肪肝。摄食鱿鱼后，脂肪肝大鼠的肝脏脂质浓度显著下降，肝脏TC和TG浓度均显著低于模型组，表明鱿鱼的摄食可显著改善乳清酸诱导的大鼠脂肪肝。

研究表明，摄食乳清酸引起的大鼠脂肪肝与肝脏TG积累和肝脏脂肪合成增加有关[7,16]。肝脏脂质代谢过程中，多种酶参与了脂肪酸的合成代谢，ME和G6PDH为脂肪酸合成提供NADPH，FAS可催化乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成脂肪酸，是肝脏脂肪酸合成的关键限速酶。酶活性测定结果显示，摄食乳清酸后，大鼠肝脏ME、G6PDH以及FAS活性均显著高于正常对照组，与文献报道一致[17]。摄食鱿鱼后，ME、G6PDH和FAS的活性不仅显著低于模型组，甚至低于正常对照组，而Tanaka 等[1]对鱿鱼的研究同样证明摄食鱿鱼可以抑制大鼠肝脏内甘油三酯的合成。另外，CPT-1和过氧化物酶体β-氧化酶系是脂肪酸分解的重要酶系，CPT-1位于线粒体外膜，可以催化脂酰-CoA转化为脂酰-肉碱，进一步向线粒体内部运输，是线粒体脂肪酸β-氧化过程的限速酶。而在长链脂肪酸β-氧化反应中，过氧化物酶体β-氧化酶系的氧化能力占脂肪酸β-氧化总量的5%～30%，是影响脂肪酸β-氧化反应的重要因素。脂肪酸分解酶活性测定结果显示，模型组大鼠肝脏CPT-1活性显著降低，过氧化物酶体β-氧化酶系无显著变化，而摄食鱿鱼后，CPT-1活性虽然和模型组相差不大，但是过氧化物酶体β-氧化酶系活性显著升高。上述结果表明，摄食鱿鱼可以降低肝脏脂肪酸合成相关酶活性并升高脂肪酸分解酶的活性，进而抑制脂肪肝大鼠肝脏内脂质的蓄积。

鱿鱼中富含n-3多不饱和脂肪酸和牛磺酸。流行病学调查表明，日常摄入较多的富含多不饱和脂肪酸的海产品可以显著降低脂肪肝发病率[18]。动物实验结果显示，摄食鱼油可以降低Fischer344(F344)大鼠的体质量、体脂肪和肝脏脂肪，同时可以升高禁食后F334大鼠过氧化物酶增殖体激活受体a(PPARa)、CPT-1和酰基辅酶A (ACO)活性，降低FAS、肝组织固醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP-1C)和硬脂酰CoA去饱和酶-1 (SCD-1)的活性[19]。而对于牛磺酸的研究同样证明，牛磺酸可以有效治疗非酒精性脂肪肝[20]。因此，摄食鱿鱼降低脂肪肝大鼠肝脏内的脂肪蓄积可能与鱿鱼中含有丰富的鱼油和牛磺酸有关。

体内脂肪的蓄积与食物中脂肪的消化吸收率密切相关，本研究进一步考察摄食鱿鱼对乳清酸诱导的脂肪肝大鼠脂质的消化和吸收的影响，结果显示，摄食鱿鱼后，大鼠总脂质和中性固醇的排泄未见升高，表明摄食鱿鱼对乳清酸诱导的大鼠脂肪肝的改善作用与脂质的消化和吸收无关。

综上所述，摄食鱿鱼可以有效抑制乳清酸诱导的脂肪肝肝脏脂肪蓄积。可能对非酒精性脂肪肝有一定的预防作用。

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Effects of Dietary Squid on Lipid Metabolism in Rats with Orotic Acid-induced Fatty Liver

WANG Yu-ming，REN Bing-xing，HU Xiao-qian，ZHANG Bei，DU Lei，WANG Jing-feng，XUE Chang-hu*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To investigate the effect of dietary squid on lipids metabolism in fatty liver in rats. Methods: Twenty four male SD rats were randomly divided into 3 groups and control group. The control was fed AIN76 diet and model group AIN76 diet plus 1% orotic acid, while squid group AIN76 diet plus 1% orotic acid and 10% squid. After 10 days, serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC)，and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels were determined. Hepatic lipid concentrations (TG, TC, PL) and the activities of malic enzyme (ME), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), fatty acid synthase (FAS), carnitin palmitoyl transferase (CPT), peroxisomal β-oxidation enzymes were also examined. Results: After fed orotic acid, liver TC and TG levels were significantly increased, so did the activity of FAS, ME and G6PDH, but the activity of CPT drop. Taking squid could reduce the liver TC and TG and the activity of FAS, ME, G6PDH but increased the activity of peroxisomal β-oxidation enzymes in orotic acid-induced fatty liver in rats. Conclusion: This study indicated that the dietary squid could inhibit liver lipids cumulating in orotic acid-induced fatty liver in rats by reducing the activity of FAS, ME and G6PDH and increasing the activity of peroxisomal β-oxidation enzymes.

squid；fatty liver；orotic acid；lipids metabolism；enzyme activity

R151.2

A

1002-6630(2011)03-0212-04

2010-05-10

国际科技合作项目(2010DFA31330)

王玉明(1973—)，男，副教授，博士，研究方向为食品营养。E-mail：wangyuming@ouc.edu.cn

*通信作者：薛长湖(1964—)，男，教授，博士，研究方向为水产品加工。E-mail：chxue@ouc.edu.cn