乳源β-酪啡肽-7对高血糖大鼠小肠黏膜氧化应激的影响

2011-03-30 10:00韩东宁张源淑
食品科学 2011年3期
关键词:高血糖小肠低剂量

印 虹,马 畅,韩东宁,张源淑

乳源β-酪啡肽-7对高血糖大鼠小肠黏膜氧化应激的影响

印 虹,马 畅,韩东宁,张源淑*

(南京农业大学 农业部生理生化重点开放实验室,江苏 南京 210095)

为了探讨主要的乳源活性肽β-酪啡肽-7对高血糖大鼠小肠黏膜氧化应激损伤的保护作用。本研究选用SD雄性大鼠43只,随机取35只诱导高血糖模型,另8只作为空白对照。造模成功大鼠24只随机分为高、低剂量组和模型对照组。高、低剂量组每12h灌胃β-CM-7溶液1mL,高剂量组β-CM-7浓度为7.5×10-6mol/L,低剂量组β-CM-7浓度为7.5×10-7mol/L,模型对照组、空白对照组大鼠按等体积蒸馏水灌胃。连续灌胃30d后,断颈处死,取血浆、小肠黏膜等进行小肠黏膜Na+-K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性与丙二醛含量测定。结果表明:低剂量组能显著提高高血糖大鼠小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力及CAT活力(P<0.05);高、低剂量组均能显著提高高血糖大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px酶活力(P<0.05);低剂量组能显著降低高血糖大鼠小肠黏膜MDA含量。结论:β-CM-7可以通过上调小肠黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化应激酶活性,缓解高血糖氧化应激产生的自由基对机体小肠黏膜的损伤。

高血糖;小肠黏膜;Na+-K+-ATP酶;氧化应激

糖尿病是威胁人类健康的三大杀手之一。近年来发现糖尿病及其并发症的发生与机体的氧化应激增加有关。许多研究表明,糖尿病的高血糖等因素使大鼠氧自由基大量产生,且清除氧自由基的酶 SOD、GSH-Px等因非酶性糖基化反应而活性降低,对自由基的清除减少,两者共同导致氧化应激加重。氧化应激损害胰岛素合成和分泌,损害肌肉、脂肪和肝脏等组织细胞正常生理功能,使得血糖持续升高,促进了糖尿病的发生和发展[1],氧化应激已经成为糖尿病发生发展的一个重要原因[2]。预防和抵抗糖尿病及其并发症的关键不仅要控制血糖,抗氧化剂用于糖尿病的治疗也已经开始起步。

β-酪啡肽-7(β-CM-7)是由酪蛋白酶解产生的最具代表性的一种乳源生物活性肽,由7个氨基酸组成。研究发现β-CM-7具有多种生物学功能,如促进仔猪小肠绒毛的生长[3];提高断奶仔猪胃肠道细胞免疫和黏膜免疫活性[4];下调小肠黏膜钠葡萄糖共转运载体(SGLT-1)、葡萄糖协助扩散转运载体(GLUT-2)mRNA的转录,减少大鼠小肠对葡萄糖的吸收[5]等。宗亚锋[6]的研究证实β-CM-7能够抑制小肠葡萄糖的吸收,有辅助降血糖作用。也有研究从酪蛋白的胃蛋白酶酶解物中分离并鉴定了具有自由基清除活性的肽[7]。β-CM-7对于小肠黏膜抗氧化应激的研究却未见报道。

本研究拟以链脲佐菌素诱导大鼠高血糖模型,结合小肠黏膜MDA、SOD、GSH-Px等指标的变化,探讨β-CM-7对糖尿病持续高血糖大鼠小肠黏膜抗氧化应激的作用,为挖掘β-CM-7对于糖尿病治疗的潜在价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

SD大鼠,雄性,购自浙江省实验动物中心(许可证号:SCXK(浙)2008-0033);标准鼠粮购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司;大鼠饲养于南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室动物房。

链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、β-酪啡肽-7 (β-Casomorphin-7,β-CM-7) 美国Sigma公司;Na+-K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;STZ用0.1mol/L、pH4.2 的柠檬酸钠缓冲液溶解,配成4mg/mL的溶液,现用现配;其他试剂为国产分析纯。

怡成血糖仪、怡成虹吸式血糖试纸 北京怡成生物电子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 STZ 致高血糖模型的建立

参照余传林[8]的方法。SD大鼠43只,雄性,体质量120~140g,随机取其中35只作为高血糖模型组,另8只作为空白对照组。给药前大鼠禁食、过夜,高血糖模型组大鼠按60mg/kg(以体质量计)一次性腹腔注射STZ溶液,另8只对照组大鼠按同样方法腹腔注射等体积生理盐水。给药后大鼠自由采食与饮水,观察并记录摄食与饮水的变化。

分别于注射STZ后24、72h剪尾取血,用血糖仪测定所有实验动物的空腹(禁食8h)血糖。以空腹条件下血糖值≥14mmol/L为高血糖造模成功。

1.2.2 动物分组和样品采集

取造模成功大鼠24只随机分为β-CM-7高剂量组(7.5× 10-6mol/L),β-CM-7 低剂量组(7.5×10-7mol/L)和β-CM-7模型对照组(0mol/L)。每12h灌胃β-CM-7溶液1mL,模型对照组和空白对照组大鼠按等体积蒸馏水灌胃。30d后,断颈处死所有大鼠,取血浆、小肠黏膜等组织,-70℃保存。

1.2.3 小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力测定

将刮取的肠囊黏膜按照试剂盒说明书检测其Na+-K+-ATP酶活力。

样本前处理:准确称取肠黏膜组织50mg加入生理盐水450μL制成10%的匀浆,3500r/min离心10min,取上清液再用生理盐水按1:4稀释成2%的匀浆待测。Na+-K+-ATP酶活力测定按试剂盒说明书进行。

1.2.4 小肠黏膜SOD、GSH-Px、CAT酶活力以及MDA含量的测定

按试剂盒说明书进行测定。

1.2.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 β-CM-7对大鼠小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力的影响

图1 β-CM-7对大鼠大肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力的影响(n=8)Fig.1 Effect of β-casomorphin -7 on the activity of Na+-K+-ATPase in small intestine mucosa (n=8)

由图1可知,模型对照组大鼠小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力显著低于空白对照组(P<0.05)。而低剂量组大鼠小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力显著高于模型对照组大鼠(P<0.05)。

2.2 β-CM-7对大鼠小肠黏膜MDA含量的影响

MDA是机体氧化应激的重要标志物之一。由表1可知,模型对照组大鼠小肠黏膜MDA含量显著高于空白对照组大鼠(P<0.05);低剂量组大鼠小肠黏膜MDA含量要显著低于模型对照组大鼠(P<0.05)。

表1 大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力以及MDA含量(n=8)Table 1 Activities of SOD, GSH-Px and catalase and the levels of MDA in small intestine mucosa in control and treatment groups of rats (n = 8)

2.3 β-CM-7对大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力的影响

由表1可知,模型对照组大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px活力显著低于空白对照组大鼠(P<0.05)。而高剂量组大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px活力均显著高于模型对照组大鼠(P<0.05),低剂量组大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力均显著高于模型对照组大鼠(P<0.05)。

3 讨 论

STZ被广泛用于实验糖尿病大鼠模型的诱导[9],STZ对胰岛β细胞有特异的毒力作用,其机制[10-11]是其对DNA的烷基化,继而激活了DNA聚合酶的切除修复途径。活化的DNA聚合酶使得胰岛NAD+耗竭,加剧了胰岛β细胞的凋亡。STZ诱导的动物模型是Ⅰ型糖尿病,表现为胰岛素的缺乏、高血糖特征。本实验采用STZ腹腔注射诱导的35只大鼠中,有24只空腹血糖稳定维持在14mmol/L以上,表明本实验STZ诱导高血糖大鼠模型成功。

机体在高血糖的状况下代谢紊乱,自由基的产生加剧,自由基的清除处于失衡状态,因此机体处于氧化应激的状态[1]。MDA是公认的氧化应激的标志物之一[12]。本实验中模型对照组大鼠小肠黏膜MDA含量显著高于空白对照组大鼠(P<0.05),提示高血糖时小肠黏膜与大量文献[1-2,13]报道的肝脏、肌肉等一样,也处于氧化应激状态。低剂量灌胃β-CM-7能显著降低糖尿病大鼠小肠黏膜的MDA含量(P<0.05),表明β-CM-7能减轻糖尿病大鼠小肠黏膜的氧化应激水平,对高血糖所致的小肠黏膜损伤有一定的抵抗作用。

机体抵抗氧化应激[14]主要通过两个途径进行。即:1)提高抗氧化应激酶的活性,包括SOD、GSH-Px、CAT等;2)通过食物摄入一些抗氧化物质,如:VA、VC、VE等。胡文琴等[7]研究发现,酪蛋白的酶解物具有较强的抗氧化作用,其作用机制可能与直接清除活性氧、提高SOD活性或是抑制膜性结构上的脂质过氧化作用有关。本实验中模型对照组大鼠小肠黏膜SOD等活力的降低,使得小肠黏膜氧化应激程度加剧,与文献[1]报道结果一致。高剂量的β-CM-7灌胃能显著提高糖尿病大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px活力,低剂量的β-CM-7灌胃能显著提高糖尿病大鼠小肠黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力,提示β-CM-7能通过上调小肠黏膜抗氧化应激的酶活力来增强其抗氧化应激的能力,等与胡文琴等[7]的研究结果一致。

小肠黏膜是机体主要的消化吸收场所。大部分营养物质(例如葡萄糖、氨基酸)的吸收是通过小肠黏膜进行的[15],葡萄糖的吸收属于主动运输,需要Na+-K+-ATP酶提供能量。本实验中模型对照组大鼠小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力与空白对照组相比,显著降低(P<0.05),灌胃酪啡肽后Na+-K+-ATP酶活力高于模型对照组。Maeda等[12]报道机体或组织若处于氧化应激的状态,过多的自由基会进攻酶的活性中心,使得一些重要的酶或者蛋白质失去其生理学功能。本实验中模型对照组小肠黏膜中Na+-K+-ATP酶活力下降,推测其与小肠黏膜处于氧化应激的状态有关。

综上所述,持续高血糖可以引起小肠黏膜处于氧化应激状态,β-CM-7可以通过显著上调小肠黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化应激酶的活性,提高小肠黏膜Na+-K+-ATP酶活力,增强小肠黏膜抗氧化应激的能力,缓解高血糖氧化应激产生的自由基对小肠黏膜的损伤,即β-CM-7对糖尿病大鼠小肠黏膜有一定的保护作用。

[1]VALKO M, LEIBFRITZ D, MONCOL J, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2007, 39(1): 44-84.

[2]NEWSHOLME P, HABER E P, HIRABARA S M, et al. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and nonmitochondrial ROS production and activity[J]. Journal of Physiology-London, 2007, 583(1): 9-24.

[3]潘翠玲, 邹思湘, 陈伟华, 等.β-酪啡肽7对早期断乳仔猪消化道发育的影响[J]. 中国兽医学报, 2006, 26(1): 78-81.

[4]张源淑, 邓艳, 宋晓丹, 等. 酪啡肽及其酪蛋白水解肽对早期断奶仔猪分泌型免疫球蛋白A和细胞因子水平的影响[J]. 动物营养学报,2008, 20(2): 196-199.

[5]宋晓丹, 左伟勇, 范英兰, 等. 乳源β-酪啡肽7对大鼠葡萄糖吸收的影响及其作用机制[J]. 世界华人消化杂志, 2009, 17(19): 1947-1951.

[6]宗亚峰. β酪啡肽在胃肠道内的释放、吸收和稳定特性及其对胃肠机能的影响[D]. 南京: 南京农业大学, 2007: 104-107.

[7]胡文琴, 王恬, 霍永久, 等. 酪蛋白酶解物体外抗氧化作用的研究[J].食品科学, 2004, 25(4): 158-162.

[8]余传林, 朱正光. 链脲佐菌素糖尿病模型动物血糖及体征动态变化的研究[J]. 南方医科大学学报, 2008, 28(1): 132-133.

[9]SZKUDELSKI T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action inβ-cells of the rat pancreas[J]. Physiol Res, 2001, 50(6): 537-546.

[10]BENNETT R A, PEGG A E. Alkylation of DNA in rat tissues following administration of streptozotocin[J]. Cancer Res, 1981, 41(7): 2786-2790.

[11]BOLZAN A D, BIANCHI M S. Genotoxicity of streptozotocin[J]. Mutat Res, 2002, 512(2/3): 121-134.

[12]MAEDA Y, INOGUCHI T. Oxidative stress[J]. Nippon Rinsho, 2010, 68(5): 814-818.

[13]WANG Q, PFISTER F, DORN-BEINEKE A, et al. Low-dose erythropoietin inhibits oxidative stress and early vascular changes in the experimental diabetic retina[J]. Diabetologia, 2010, 53(6): 1227-1238.

[14]HAMDEN K, BOUJBIHA M A, MASMOUDI H, et al. Combined vitamins (C and E) and insulin improve oxidative stress and pancreatic and hepatic injury in alloxan diabetic rats[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2009, 63(2): 95-99.

[15]邹思湘. 动物生物化学[M]. 4版. 北京: 中国农业出版社, 2005: 102-103.

Effects of β-CM-7 on the Oxidative Stress of Small Intestine Mucosa in Diabetic Rats

YIN Hong,MA Chang,HAN Dong-ning,ZHANG Yuan-shu*
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The present study was aimed to investigate the possible protective effects of β-casomorphin -7 in small intestine mucosa in diabetic rats. A total of 43 male SD rats were used for this stud and were divided into two groups of control (n = 8) and hyperglycemia group (n = 35). The hyperglycemia rats (n = 24) were randomly divided into three groups: positive control rats, high dose β-CM-7 treated diabetic rats, and low dose β-CM-7 treated diabetic rats. On the last day of treatment, the animals were deprived of food overnight and sacrificed by cervical dislocation. Blood was collected at the presence of anticoagulant and the small intestine mucosa was obtained. The MDA level and the activity of Na+-K+-ATPase, SOD, GSH-Px, and CAT of small intestine mucosa were measured. The results showed after 30 days oral administration of β-casomorphin -7, the activity of Na+-K+-ATPase was markedly increased compared with positive control rats. Oral administration of high or low does of β-CM-7 to diabetic rats showed an increase in the activity of SOD, and GSH-Px, and low does also showed the reducing function on the elevated MDA level in diabetic rats. Thus the results of the present study suggest that β-casomorphin -7 can decrease the oxidative stress in small intestine mucosa in diabetic rats by elevating the activity of enzymatic antioxidants including SOD and GSH-Px.

hyperglycemia;small intestine mucosa;Na+-K+-ATPase;oxidative stress

S858

A

1002-6630(2011)03-0208-04

2010-05-24

印虹(1984—),男,硕士研究生,研究方向为生物活性肽。E-mail:2008107031@njau.edu.cn

*通信作者:张源淑(1962—),女,教授,博士,研究方向为生物活性肽。E-mail:zhangyuanshu@njau.edu.cn

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