马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆作用的研究

张洪江，张红英，王 玉

马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆作用的研究

张洪江1，张红英2,*，王 玉3

(1.延边大学附属医院检验科，吉林 延吉 133000；2.延边大学基础医学院机能学实验中心，吉林 延吉 133002；3.延边大学医学部，吉林 延吉 133002)

目的：研究马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆能力及其作用机制。方法：取小鼠随机分为正常组、模型组、马齿苋正丁醇提取物(0.5、0.25g/(kg·d))组。除正常组颈部皮下注射生理盐水外，其他各组均皮下注射D-半乳糖(1g/(kg·d))，注射后每天下午灌胃给药，连续造模42d。采用避暗和水迷宫法测定衰老小鼠学习记忆能力，同时测定小鼠脑组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果：马齿苋正丁醇提取物组均可提高衰老小鼠学习记忆能力，并明显降低脑组织MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性。结论：马齿苋正丁醇提取物能明显改善衰老小鼠学习记忆障碍，其机制可能与提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有关。

马齿苋；正丁醇；学习记忆；MDA；SOD；GSH-Px

马齿苋(Portulaca oleracea Linn)广泛分布于我国南北地区，资源丰富，是一种具有很大开发潜力的植物。马齿苋科植物的全草又名长寿菜，性寒味酸具有清热解毒、散血消肿之功效。马齿苋是中国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。马齿苋含有丰富的化学成分，具有广泛的药理活性及营养保健作用[1]。曾小玲[2]报道鲜马齿苋沸水提取物对超氧阴离子自由基和羟自由基均有显著的清除作用。马齿苋水提液可明显延长模型小鼠的缺氧生存时间、爬杆时间，提高其高温存活率[3]，据此推测马齿苋提取物可能具有改善学习记忆的作用。本实验研究马齿苋提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆的影响，从清除氧自由基的能力方面初步探讨其作用机制。为进一步开发应用马齿苋提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

马齿苋购于吉林省延边大学附属医院中药房，经延边大学药学院生药教研室刘永镇教授鉴定为真品。

昆明种小鼠(均为雌性)，体质量24～26g，由延边大学医学院动物科提供(动物合格证号：10-1022)。

D-半乳糖(批号F20080429) 国药集团化学试剂有限公司；SOD、MDA、GSH-Px试剂盒(批号2008.11.23)南京建成生物工程研究所。

2H-500型小鼠避暗仪 安徽正华教学实验机械厂；LW-Π型自动记录水迷宫 中国医学科学院药物研究所；YP600型电子称、VIS-723型可见分光光度仪 上海精密科学仪器有限公司；超级恒温水浴装置 上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 马齿苋正丁醇提取物制备

称取马齿苋干草1300g粉碎，用体积分数75%乙醇在水浴中回流提取2次，先用10倍量乙醇提取2h，然后再用8倍量乙醇提取1h，冷却后过滤，合并滤液浓缩，水悬浮液以乙酸乙酯萃取浓缩至浸膏，水层挥尽乙酸乙酯，用饱和正丁醇萃取。正丁醇层浓缩得浸膏，干燥成粉末，临用前配成所需浓度。

1.2.2 实验分组造模及给药

取雌性昆明种小鼠，在实验室适应2d，随机分为4组，即正常组、模型组、马齿苋正丁醇提取物(0.5、0.25g/(kg·d)，以体质量计)组。D-半乳糖致衰老小鼠模型的制备[4]：采用无菌注射方法，每日上午，除正常组颈部皮下注射生理盐水外，其他各组均皮下注射D-半乳糖(1g/(kg·d))进行造模，每日1次连续造模42d。注射D-半乳糖后每日下午，生理盐水和模型组灌胃给蒸馏水，药物组灌胃给马齿苋正丁醇提取物，每日1次连续灌胃给药42d。

1.2.3 小鼠避暗实验[5]

避暗箱大小为36cm×12cm×12cm，分为前后明暗室两部分，两室间有直径3cm的圆洞相通，底部为铜栅，暗室后半部通以40V电压。训练时将小鼠背对洞口放入明室，暗室底部通电，同时启动计时器，小鼠穿过洞口进入暗室触电的时间，为实验潜伏期，进行训练5min，24h后进行正式实验，将小鼠背对洞口放入明室，同时启动计时器，记录每只小鼠第1次进入暗室的时间，即为逃避潜伏期，并记录5min内进入暗室的次数(即避暗错误次数)。

1.2.4 小鼠水迷宫实验[6]

装置为32cm×12cm×25cm双层不透明的有机玻璃槽，实验时水深为10cm，水温保持25℃左右。第一次训练前将小鼠放在梯子附近，使其自行爬上3次，然后将小鼠背对出口放入A点开始训练。第二次训练前将小鼠放在梯子附近，使其自行爬上一次，将小鼠背对出口放入B点开始训练。正式实验时将小鼠背对出口从B点开始放入小鼠，同时按下启动键，仪器开始自动记时，小鼠到达终点或时间到2min时，仪器自动停记。

1.2.5 脑组织蛋白质、MDA含量及SOD、GSH-Px活性的测定

实验结束后，取脑组织冰浴研磨，并用冷生理盐水制成10%匀浆液，3500r/min离心10min，取上清液按试剂盒方法测定脑组织蛋白质、MDA含量和SOD、GSH-Px活性(以单位质量蛋白计)。

1.2.6 统计学处理

2 结果与分析

2.1 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响(避暗法)

表1 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响Table 1 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in stepthrough test

表1 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响Table 1 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in stepthrough test

注：*.与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与模型组相比，有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

组别剂量/动物数 避暗法测定指标(g/(kg·d))潜伏期/s错误次数正常组—1591.54±2.800.87±0.92模型组—1229.73±3.755.17±6.94提取物高剂量组0.512109.78±5.51**0.42±0.67**提取物低剂量组0.2517140.63±4.12**0.18±0.53**

由表1可知，与正常组相比，模型组小鼠潜伏期明显缩短和错误次数明显增加；与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物组均可使衰老小鼠潜伏期延长和错误次数明显减少(P＜0.01)。

2.2 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响(水迷宫法)

表2 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响Table 2 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in water maze (x±s)

表2 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响Table 2 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on learning ability and memory in senile mice induced by D-Gal in water maze (x±s)

组别剂量/动物数 水迷宫法测定指标(g/(kg·d))到达时间/s错误次数正常组—1558.23±26.93**10.92±8.69**模型组—12102.36±30.5824.36±7.46提取物高剂量组0.51248.45±38.35**8.50±4.97**提取物低剂量组0.251758.25±28.41**11.50±5.68**

由表2可知，与正常组相比，模型组小鼠到达时间延长和错误次数明显增加；与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物组均可使衰老小鼠到达时间缩短和错误次数明显减少(P＜0.01)。

2.3 对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织SOD、MDA、GSH-Px的影响

表3 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织SOD、MDA、GSH-Px的影响Table 3 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on SOD, MDA, and GSH-Px leve in brain tissue of senile mice induced by DGal

表3 马齿苋正丁醇提取物对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织SOD、MDA、GSH-Px的影响Table 3 Effect of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on SOD, MDA, and GSH-Px leve in brain tissue of senile mice induced by DGal

组别剂量/动物数SO D/MD A含量/GSH-P X/ (g/(kg·d))(U/m g)(nmol/ mg)(U/ mg )正常组—1089.8±14.6*4.8±0.762.7±19.2模型组—1042.6±13.25.0±1.533.2±8.5提取物高剂量组0.51081.0±33.5*4.0±0.951.4±12.9**提取物低剂量组0.251063.5±14.73.3±0.8*48.9±19.9

由表3可知，与正常组相比，模型组小鼠脑组织SOD、GSH-PX活性下降；与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))组可使衰老小鼠脑组织SOD、GSH-PX活性明显上升(P＜0.05，P＜0.01)；与正常组相比，模型组小鼠脑组织MDA含量明显上升；与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))组可使衰老小鼠脑组织MDA含量明显下降(P＜0.05)。

3 讨 论

衰老是生命过程中正常而又复杂的生物过程，有关衰老的学说很多，1956年所提出的自由基衰老假说受到广泛的支持[7]。

D-半乳糖致衰老小鼠模型：D-半乳糖在半乳糖氧化酶作用下，氧参与反应，生成糖和过氧化氢反应过程中产生超氧阴离子自由基，其过量损伤可产生衰老反应。该模型在一定时间内连续注射D-半乳糖，使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化作用下，还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，致细胞肿胀，功能障碍代谢紊乱，氧自由基堆积最终致机体衰老[7]。连续颈背部皮下注射造成衰老模型，此模型造模简单易行，不需要特殊设备，本模型基本接近自然衰老过程。

避暗法实验中，D-半乳糖可使衰老小鼠潜伏期明显缩短和错误次数明显增加，与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物组均可使衰老小鼠潜伏期明显延长和错误次数明显减少。

水迷宫法实验中，D-半乳糖可使衰老小鼠到达时间延长和错误次数明显增加，与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物均可使衰老小鼠到达时间明显缩短和错误次数明显减少。说明马齿苋正丁醇提取物可提高衰老小鼠学习记忆能力。

自由基学说认为引起人体衰老的主要原因是人体细胞代谢过程中产生的自由基，因其具有高度的化学性，并能与活细胞的大部分发生反应，损伤DNA分子，造成DNA键的断裂，使细胞死亡或发生突变[8]。

SOD作为机体内主要的抗氧化酶对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。此酶可促使超氧阴离子自由基转变为过氧化氢，从而减少脂过氧化反应，使机体细胞和组织免受损害，其活力的高低间接反应映了机体清除氧自由基的能力，并与衰老、肿瘤、炎症等有着密切联系[9]。实验结果表明，与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))组能提高衰老小鼠脑组织SOD活性。

MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂过氧化物，它能生成聚合物并与人体内的蛋白质和脱氧核糖核酸发生反应，使蛋白质的结构发生变异，导致变异蛋白质的细胞失去正常功能并向初期癌细胞转化，从而导致癌症的发生。MDA含量的变化可间接反应组织中氧自由基含量的变化量[10]。实验结果表明，与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))组可明显降低衰老小鼠脑组织MDA含量。

GSH-Px是机体广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽H2O2的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，从而减缓衰老过程[11]。与模型组相比，马齿苋正丁醇提取物(0.5g/(kg·d)) 组能提高衰老小鼠脑组织GSH-Px活性。

本次实验中，D-半乳糖可使衰老小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性显著下降，MDA含量有所上升，马齿苋正丁醇提取物(0.5g/(kg·d))组可使衰老小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性明显上升，马齿苋正丁醇提取物(0.25g/(kg·d))组可使衰老小鼠脑组织MDA含量明显下降。说明，马齿苋正丁醇提取物可能通过增加氧自由基清除能力来改善学习记忆障碍。

综上所述，马齿苋正丁醇提取物可提高衰老小鼠学习记忆能力，其机制可能与提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量有关。

[1]中药大辞典(上下)(精)[M]. 上海: 上海科学技术出版公司, 2006: 1635-1758.

[2]曾小玲. 马齿苋水提取物对氧自由基清除作用的研究[J]. 湖南医科大学学报, 1999, 24(2): 133-135.

[3]杜历生. 衰老机理和延缓衰老的措施[J]. 广西中医学院学报, 2001, 4(4): 108-110.

[4]陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 2006: 954.

[5]候悦, 吴春福, 何祥, 等. 氯氮平、奥氮平对小鼠在避暗实验中学习记忆获得、巩固和再现过程的影响[J]. 中国临床康复, 2006, 38 (10): 61-64.

[6]徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 828.

[7]李文彬, 韦丰, 范朋, 等. D-半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 1995, 9(2): 93-96.

[8]HARMAN D. Aging: a theory based on free radical and radiationchemistry [J]. J Gerontol, 1956, 11: 298-301.

[9]GIARDINO R, GIAVARESI G, FINI M, et al. The role of different chemical modifications of superoxide dismutase in preventing a prolonged muscular ischemia/reperfusion injury[J]. Arit Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 2002, 30(1): 189-198.

[10]LIMOLI C L, KAPLAN M I, GIEDZINSKI E, et al. Attenuation of radiation-reduced genomic instability by free radical scarengers and cellular proliferation[J]. Free Radio Boil Med, 2001, 31(1): 10-15.

[11]LASCO M A, FUNK W, VILLEPONTEAU B, et al. Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA[J]. Science, 1995, 269(5228): 1267-1271.

Effects of n-Butanol Extracts from Portulaca oleracea on the Learning and Memory Performances of Senile Mice Induced by D-Gal

ZHANG Hong-jiang1，ZHANG Hong-ying2,*，WANG Yu3
(1. Clinical Laboratory Room, Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China；2. Functional Laboratory Center, Basic Medical College of Yanbian University, Yanji 133002, China；3. Yanbian University Health Science Center, Yanji 133002, China)

Objective: To study the effects of n-butanol extracts from Portulaca oleracea on the learning and memory performances of senile mice induced by D-gal and its mechanisms. Method: The mice were randomly divided into 3 groups: control group, model group and the n-butanol extracts (0.5 g/(kg·d) and 0.25 g/(kg·d)) groups. The control group was given hypodermic injection of isotonic NaCl in the transverse part while the other groups successively administered with D-gal (1 g/(kg·d)). After injection of medicine in the afternoon of every day model animals were obtained after 42 d of treatment. Learning and memory performances were measured by step-through test and water maze test and the amount of MDA in mouse brain tissue and the activities of SOD and GSH-Px were determined. Results: Portulaca oleracea n-butanol extracts could improve the learning and memory performances of mice at both 0.5 g/(kg·d) and 0.25 g/(kg·d), and substantially reduce contents of MDA in brain tissues and improve activities of SOD and GSH-Px. Conclusion: Portulaca oleracea n-butanol extracts can markedly improve learning and memory performances of senile mice. The mechanisms of effects may be related to the improvement of SOD and GSH-Px activities and the decrease of MDA.

Portulaca oleracea；n-butanol；learning and memory；MDA；SOD；GSH-Px

TS255.1

A

1002-6630(2011)03-0204-04

2010-05-31

张洪江(1968—)，男，主管检验师，研究方向为中药生化药理。E-mail：zhj1181@msn.cn

*通信作者：张红英(1952—)，女，高级实验师，研究方向为中药心血管与抗衰老。E-mail：zhanghongying52@163.com