红酵母Y-5产类胡萝卜素培养基无机盐组分的优化

唐 棠，黄乾明，杨群峰

红酵母Y-5产类胡萝卜素培养基无机盐组分的优化

唐 棠，黄乾明*，杨群峰

(四川农业大学生命科学与理学院，四川 雅安 625014)

为提高红酵母菌株Y-5发酵产类胡萝卜素的产量，对培养基中无机盐组分进行优化。采用Plackett-Burman试验设计从8种无机盐中筛选出对提高类胡萝卜素产量具有显著效应的无机盐组分KH2PO4、MgSO4和NaCl。通过Box-Behnken设计及响应面分析确定其质量浓度为KH2PO4 0.58g/L、MgSO4 0.49g/L、NaCl 0.28g/L时，菌株的类胡萝卜素产量达到14.51mg/L，与未添加无机盐组分培养基相比，类胡萝卜素产量提高了25.09%。

红酵母Y-5；类胡萝卜素；无机盐；Plackett-Burman设计；响应面分析

类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素，在动物、植物、真菌、藻类和细菌中都有发现，主要化学成分包括β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素。类胡萝卜素作为人和动物体内的一类重要生物活性物质，在增强机体免疫、防治肿瘤、治疗光敏性疾病等方面有重要的作用。在食品、化妆品、医药和饲料添加剂等方面都有着广泛的应用[1-3]。类胡萝卜素的生产方法主要有天然产物提取和化学合成。从植物、藻类等中提取类胡萝卜素容易受到自然条件限制，化学合成的产品鉴于其自身存在毒性，已不为人们所接受[4]。许多微生物具有合成类胡萝卜素的能力，红酵母发酵生产类胡萝卜素因其安全无毒、生产周期短、发酵易于调控，其研究日益受到重视。但红酵母产类胡萝卜素的产量普遍较低[5]，影响其产量的众多因素中，培养基中无机盐组分对红酵母菌株的生长以及类胡萝卜素产量有重要的作用[6-7]。

利用Plackett-Burman试验设计可用最少的试验次数从众多考察因素中快速有效地筛选出显著因素[8]。响应面法能够建立连续变量曲面模型，对影响生产过程的各因素及其交互作用进行评价，并对最优结果进行预测。与传统优化方法相比，响应面法所需的试验组数更少[9]。这两种方法目前已经广泛地应用于培养基组分的优化。

本实验采用Plackett-Burman法和响应面法对本实验室选育的红酵母菌株Y-5发酵培养基无机盐组分进行了优化，以提高类胡萝卜素产量，为红酵母发酵产类胡萝卜素工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

红酵母(Rhodotorula sp.)菌株Y-5，由本实验室分离保藏。

1.1.2 培养基

斜面活化培养基：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH值自然；液体种子培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母粉10g、蒸馏水1000mL，pH值自然；发酵培养基：葡萄糖50g、蛋白胨8g、酵母粉10g、蒸馏水1000mL，pH5.0。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

将菌种从斜面活化培养基中接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃、150r/min培养24h后，再将其以10%的接种量接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃、150r/min培养13h；最后将种子液以10%接种量接入到装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中，按照试验设计加入不同种类无机盐组分，28℃、150r/min振荡培养120h。

1.2.2 生物量与类胡萝卜素含量测定

将发酵液于4000r/min离心10min，移除上清液，将菌体水洗再次离心，所得菌体55℃烘干至质量恒定，称量即为生物量。准确称取干菌体0.1g，加6mL 3mol/L HCl于室温下振荡提取1h，沸水浴处理4min，迅速冷却，洗涤菌体，4000r/min离心10min，所得沉淀用6mL丙酮与石油醚(1:1，V/V)混合液在室温下振荡提取3～4次至菌体无色，将各次离心液收集即得类胡萝卜素提取液。提取液用722型分光光度计在453nm波长处测定其吸光度[10-12]，并按下式计算类胡萝卜素含量。

式中：A453nm为453nm波长处的吸光度；D为稀释倍数；V为提取所用溶剂量体积/mL；0.16为类胡萝卜素摩尔消光系数/(mol·cm)-1；m为酵母菌体质量/g。

类胡萝卜素产量/(mg/L)=生物量/(g/L)×类胡萝卜素含量/(mg/g)

1.2.3 无机盐组分优化试验设计

采用Plackett-Burman设计，最陡爬坡设计[13]，Box-Behnken设计[14]与响应面分析法[15]。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计筛选无机盐组分

表1 Plackett-Burman设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

表2 Plackett-Burman试验设计与结果Table 2 Experimental design and responses of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman试验设计结果分析表Table 3 Analysis for results of Plackett-Burman tests

根据红酵母菌株生长以及发酵特性，选取可能影响红酵母发酵产类胡萝卜素产量的8种无机盐X1(KH2PO4)、X2(Na2HPO4)、X3(MgSO4)、X4(CaCl2)、X5(NaCl)、X6(MgCl2)、X7(NaNO3)和X8(K2SO4)作为Plackett-Burman试验的8个因素进行筛选。其因素水平设计见表1，试验结果见表2，表2数据利用Minitab 15软件进行统计分析，结果见表3。由表3可知，X1(KH2PO4)、X3(MgSO4)和X5(NaCl)对红酵母发酵类胡萝卜素产量有显著影响，可信度在95%以上。且KH2PO4、MgSO4、NaCl对类胡萝卜素产量的影响均为正效应，应提高其实际水平。

2.2 最陡爬坡设计及结果

为了建立有效的响应面拟合方程，必须对Plackett-Burman试验筛选出的显著影响因素进行最陡爬坡试验，从而逼近类胡萝卜素最大产量区。根据Plackett-Burman试验结果，显著因素KH2PO4、MgSO4和NaCl的质量浓度变化方向及步长的试验设计与结果见表4，由于3种组分均表现为正效应，所以取高水平。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

由表4可知，当KH2PO40.6g/L、MgSO40.5g/L、NaCl 0.25g/L时，对应的类胡萝卜素产量达到最大值，故以试验组5对应无机盐组分的质量浓度作为B o x-Behnken试验的中心点。

2.3 响应面分析法确定显著因素的最佳水平

表5 响应面设计因素水平表Table 5 Variables and levels in RSM

表6 Box-Behnken试验设计与结果Table 6 Experimental design and response of Box-Behnken design

根据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验分析结果，确定了具有显著影响的无机盐组分以及响应面试验中心点。响应面因素和水平设计如表5所示。根据Box-Behnken中心组合试验原理，设计三因素三水平共15个试验点的响应面分析试验，其中12个是析因点，3个零点重复试验用于估计实验误差，每组实验3个平行，实验设计和结果见表6。以类胡萝卜素产量(Y)为响应值，运用Minitab软件进行二次多项式回归拟合，得到52.66，方程的相关系数R2=0.9522，P=0.008，剩余标准差s=0.2177，说明该回归方程具有较好的拟合度。回归方程系数显著性检验及方差分析见表7、8。

表7 回归方程系数显著性检验Table 7 Significance test of each coefficient of developed quadratic regression model

表8 回归方程方差分析Table 8 ANOVA analysis for regression equation

由表7、8可知，回归方程一次项、二次项的影响均超过了显著水平。交互项(X1X3、X3X5)影响显著，说明KH2PO4与MgSO4、MgSO4与NaCl的交互作用对红酵母发酵生产类胡萝卜素产量影响显著。图1、2为响应面分析的响应面图以及等高线图。对回归方程进行求解，可知当X1(KH2PO4)为0.58g/L，X3(MgSO4)为0.49g/L，X5(NaCl)为0.28g/L时，类胡萝卜素产量(Y)极大值为14.57mg/L。为检验模型预测结果，在该条件下进行实验验证，重复实验3次，得类胡萝卜素产量平均值为14.51mg/L，与模型预测结果接近，说明培养基中无机盐组分优化有效。与未加无机盐组分的培养基相比，红酵母发酵类胡萝卜素产量提高了25.09%。

图1 KH2PO4与MgSO4对类胡萝卜素产量影响的响应面图(a)及等高线图(b)Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of KH2PO4and MgSO4on carotenorid production

图2 MgSO4与NaCl对类胡萝卜素产量影响的响应面图(a)及等高线图(b)Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects ofMgSO4 and NaCl on carotenorid production

3 结 论

通过Plackett-Burman试验分析了红酵母发酵产类胡萝卜素培养基中8种无机盐组分对类胡萝卜素产量的影响，筛选出了具有显著影响的3种无机盐组分：KH2PO4、MgSO4和NaCl。采用Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法确定，当KH2PO4为0.58g/L、MgSO4为0.49g/L、NaCl为0.28g/L时类胡萝卜素产量为14.57g/L。通过对预测模型试验验证，类胡萝卜素产量为14.51g/L，与模型预测值接近。在此优化条件下，与未添加无机盐组分培养基摇瓶发酵相比，类胡萝卜素产量提高了25.09%。

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Optimization of Mineral Salts in Fermentation Medium for Carotenoid Production by Rhodotorula Y-5

TANG Tang，HUANG Qian-ming*，YANG Qun-feng
(College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In order to improve the yield of carotenoid in the fermentation of Rhodotorula Y-5, mineral salts in the fermentation medium were optimized. KH2PO4, MgSO4and NaCl were found to be the important factors affecting carotenoid production significantly by the analysis of Plackett-Burman design. The optimization results based on Box-Behnken design and response surface methodology showed that the production of carotenoid could reach 14.51 mg/L, when KH2PO4 was added at 0.58 g/L, MgSO4 at 0.49 g/L, and NaCl at 0.28 g/L. Compared with the control medium without added mineral salts, the production of carotenoid was increased by 25.09%.

Rhodotorula Y-5；carotenoid；mineral salt；Plackett-Burman design；response surface methodology

TQ920.1

A

1002-6630(2011)03-0130-04

2010-06-10

四川省教育厅重点科研项目(08ZA053)；四川农业大学科技创新基金项目(00731200)

唐棠(1983—)，女，硕士研究生，研究方向为微生物发酵。E-mail：tangtang6@163.com

*通信作者：黄乾明(1964—)，男，教授，博士，研究方向为微生物化学。E-mail：hqming@sicau.edu.cn