丹参不同部位总酚酸和总黄酮含量分析及其抗氧化活性研究

李 欣，薛治浦，朱文学

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)

丹参不同部位总酚酸和总黄酮含量分析及其抗氧化活性研究

李 欣，薛治浦，朱文学

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)

以丹参根、茎、叶为研究对象，在测定其总酚酸及总黄酮含量的基础上，以VC为阳性对照，选用还原力、DPPH自由基清除率和多不饱和脂肪酸(PUFA)过氧化体系对不同部位醇提物进行抗氧化活性评价。结果表明：叶中总酚酸和总黄酮含量显著高于其他部位，其总酚酸含量分别为根和茎的1.07倍和6.81倍；总黄酮含量分别为根和茎的4.79倍和14.5倍。在预设质量浓度为20mg/mL时，丹参叶醇提物的抗氧化活性最强，其还原力、DPPH自由基清除率、对PUFA过氧化体系的抑制作用分别相当于VC(1mg/mL)的1.08、1.01、5.78倍。总酚酸的含量和抗氧化活性之间具有很高的相关性，表明抗氧化活性可能与酚酸类物质有关。

丹参；总酚酸；总黄酮；抗氧化活性

唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)通常以根部入药，是治疗心脑血管疾病的传统中药材，具有活血化瘀、通络止痛、清热安神的功效[1]，主产于山西、河北、河南、四川、江苏、安徽等地。丹参根部主要含有两大类活性成分，其中水溶性的酚酸类成分(丹酚酸、迷迭香酸、原儿茶酸、咖啡酸、丹参素等)具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基作用[2-3]。

由于合成抗氧化剂对健康的潜在危害，近年来，从天然植物中寻找天然的抗氧化剂引起人们极大的兴趣。以往的研究表明，传统的中药材尤其是唇形科植物具有很强的抗氧化活性，并且目前已知的抗氧化物质多属于酚酸类成分。丹参是我国传统医学中应用最早而且最广泛的药物之一，每年的产量约在5000～7000t，其地上部分占全草的三分之二，却被当杂质弃去。国内外学者们对丹参根的强抗氧化活性进行了大量研究，但丹参其他部位的抗氧化活性及活性成分未见报道。研究表明，丹参地上部分不含有丹参酮类脂溶性有效成分，含有和根部相似的酚酸类有效成分[4]。本实验对丹参不同部位总酚酸、总黄酮的含量进行测定，并采用3种常用的体外抗氧化活性评价方法，对丹参不同部位乙醇提取物的抗氧化活性进行比较研究，以期为丹参进一步综合应用于医药和开发新型保健品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丹参于2009年10月采自河南孟县药材基地，经河南科技大学食品与生物工程学院朱文学教授鉴定为Salvia miltiorrhiza Bunge。将各部位样品(根、茎、叶)仔细分拣，自然晾干后，粉碎，过40目筛，冷藏备用。

芦丁和没食子酸对照品 中国药品生物制品检定所；福林试剂 上海荔达生物科技有限公司；1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) 美国Sigma公司；抗坏血酸(分析纯)、无水乙醇(分析纯)。

1.2 仪器与设备

722N型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；FA1004精密电子天平 上海上平仪器公司；HH-S6数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；KQ-500DE型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；LXJ-ⅡB型离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备[5]

各称取干燥至恒质量的丹参根、茎、叶各1g，以80%的乙醇溶液为溶剂，各加入30mL，置于50mL锥形瓶中，混匀，放入超声清洗器中超声提取30min冷却至室温，过滤取滤液，滤渣进行二次超声振荡提取，合并滤液，定容至50mL(相当20mg鲜样/mL)，密闭冷藏保存，备用。取样品液1 m L，作为试样待测。

1.3.2 总黄酮、总酚酸含量的测定

总黄酮含量的测定采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[6]，标准曲线为y=7.728x+0.0185(R2=0.9989)，其中：x为吸光度，y为提取液中总黄酮含量(mg/mL)，检测波长510nm，以芦丁来计算。

总酚酸含量的测定采用Folin-Ciocalteu法[7]，标准曲线为：y=0.007x+0.027(R2=0.9982)，其中：x为总酚含量(μg/mL)，y为吸光度，检测波长为765nm，以没食子酸来计算。

1.3.3 抗氧化活性的测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH溶液的配制：准确称取7.88mg DPPH用无水乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀，配制为浓度2×10-4mol/L的溶液，保存于冰箱中，备用。

通常的抗氧剂样品溶液在实验条件下均几乎无色，对DPPH的测量不形成干扰，一般采用Larrauri等[8]和Yokozawa等[9]的方法进行研究。但植物提取物中化学成分复杂，可能干扰吸光度的测定。因此，本实验参考杨怀霞等[10]和郭亚力等[11]的方法并进行改进，采用该法研究提取物的抗氧化活性可排除干扰。

向2.5mLDPPH的乙醇溶液中加入1mL样品，混合均匀，30min 后用分光光度计在517nm波长处测定吸光度Ai，同时测定2.5mL DPPH 的乙醇溶液与 1.0mL 80%乙醇溶液混合液的吸光度AC及2.5mL乙醇与1.0mL样品混合液的吸光度Ab，清除率按公式(1)计算：

1.3.3.2 还原能力测定

实验采用高铁盐-铁氰化钾比色法[12]测定样品的还原能力。

反应体系为： lmL样品溶液，2.5mL磷酸缓冲溶液(0.2mol/L；pH6.6)，2.5mL K3Fe(CN)6溶液(质量分数1%)，混匀，50℃下保温20min，随后加入2.5mL三氯乙酸溶液(质量分数10%)，混合后4℃离心10min(3000r/min)，取上清液2.5mL，加入2.5mL去离子水和0.5mL FeCl3溶液(质量分数0.1%)，充分混合后，静置10min，于700nm波长处测定吸光度。阳性对照为VC。

1.3.3.3 PUFA过氧化体系中抗氧化活性(AOA)的测定

采用以Fe2+诱发卵黄磷脂C2位上的极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)过不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化模型，用硫代巴比妥酸法测定样品的抗脂质过氧化作用，参照文献[13]的方法，略有改进。

卵黄悬液：新鲜鸡蛋去清，卵黄用等体积的pH 7.45，0.lmol/L 磷酸钠缓冲液(PBS)配成1:1悬液，磁力搅拌10min，再用PBS缓冲液稀释成1:25的悬液(置于冰箱中备用)。

测定方法：在具塞试管中加入0.4mL卵黄悬液，0.1mL不同浓度样品溶液，0.4mL FeSO4(25mmol/L)，3.1mLPBS(0.1mol/L；pH 7.45)，混匀于37℃恒温振荡15min，取出后加入lmL 三氯乙酸(质量分数20%)，3500r/min离心10min，吸取2mL上清液加入lmL TBA(质量分数0.8%)，加塞放入沸水浴中15min，冷却后，以空白管(3mL蒸馏水代替)调零，于532nm波长处比色测定吸光度，不加样品管(以0.1mLPBS缓冲液代替样品)的吸光度为A，样品管的吸光度为A样。样品AOA用卵黄脂蛋白脂质过氧化(LPO)的抑制率表示。

式中：AOA为样液在卵黄脂蛋白脂质过氧化体系中的过氧化抑制率；A样为加入样液反应后的吸光度平均值；A为空白组的吸光度平均值。

1.3.4 统计方法

每个实验重复3次，结果以x±s表示。数据结果采用DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 丹参不同部位总酚酸和总黄酮含量

丹参根、叶、茎各部位均含有总酚酸、总黄酮成分，但含量存在一定差异。本实验采用分光光度法测定不同部位的总酚酸、总黄酮的含量，结果见表1。

表1 丹参不同部位有效成分含量Table 1 Yields of bioactive components from different parts of Salvia miltiorrhiza Bunge

由表1可知，丹参各部位总酚、总黄酮含量叶中最高，分别为(60.82±0.84)、(15.59±0.08)mg/g，而这两类成分在茎中含量最低，分别为(8.92±1.31)、(1.07± 0.12)mg/g。叶中总酚酸和总黄酮含量显著高于根和茎部的含量，其总酚酸含量分别为根和茎的1.07倍和6.81倍，总黄酮含量分别为根和茎的4.79倍和14.5倍。

2.2 丹参不同部位的抗氧化能力

表2 丹参不同部位和VC抗氧化能力比较Table 2 Comparison of antioxidant activities between extracts from different parts of Salvia miltiorrhiza Bunge and vitamin C

由表2可知，丹参不同部位乙醇提取液在预设的质量浓度20mg/mL时的抗氧化活性存在差异。

2.2.1 各部位的总还原力

抗氧化剂的抗氧化能力与其还原力有关，还原力越大，抗氧化能力越强。抗氧化剂能够在一定的条件下将Fe3+还原为Fe2+，因此，根据Fe3+还原为Fe2+的多少来间接可以评价各种提取物的抗氧化能力[14]。由表2可知，丹参各部位还原力存在一定差异，总酚酸含量高的还原力也相对较强，其中，总酚酸含量最高的叶提取物的还原力最强，显著高于根、茎和VC(P＜0.05)，为VC(1mg/mL)的108.4%，根的还原力为VC的97.3%，总酚酸含量最低的茎的还原力最弱，仅为VC的26.3%。还原力大小顺序为叶＞VC＞根＞茎。

2.2.2 丹参各部位对DPPH自由基的清除作用

由表2可知，丹参叶醇提物对DPPH自由基的清除能力最强，为VC(1mg/mL)的101.1%，显著高于根、茎和VC；丹参根的醇提物清除DPPH自由基的能力和VC差异不显著(P＞0.05)；丹参茎醇提物清除DPPH自由基的能力最弱，显著低于VC(P＜0.05)，为VC的57.1%；丹参各部位醇提物对DPPH自由基的清除率的大小顺序为叶＞VC＞根＞茎，丹参各部位醇提物的清除能力与总酚酸含量和还原能力成正相关。

2.2.3 对PUFA过氧化体系的抑制作用

吸光度越小，表示对PUFA过氧化体系的抑制作用越强[15]。由表2可知，丹参各部位对Fe2+诱发的卵黄脂蛋白PUFA过氧化体系有明显的抑制作用，其中酚酸含量相对高的根和叶，其抑制作用也较强，分别为(83.07±2.35)%、(81.49±1.65)%，茎的抑制作用最弱。丹参各部位对PUFA过氧化体系的抑制作用显著高于VC(P＜0.05)，其作用大小顺序为：根＞叶＞茎＞VC。和VC(1mg/mL)相比，根、叶、茎的抑制作用分别相当于VC的5.89、5.78、2.41倍。

2.3 丹参不同部位有效成分含量与抗氧化活性相关性分析

表3 2种有效成分含量与抗氧化活性相关性分析Table 3 Correlation analysis of the contents of two bioactive components and antioxidant activities

由表3可以看出，丹参不同部位总酚酸的含量与其抗氧化活性之间有显著线性相关性，相关系数在P＜0.01水平上均大于0.9，说明抗氧化活性与总酚酸含量呈显著的正相关，总酚酸含量越高的样品，其抗氧化能力越强；丹参不同部位抗氧化活性和总黄酮的相关系数均小于0.55(P＜0.05)，说明总黄酮的含量与抗氧化活性之间相关性稍差。因此酚酸类物质为其抗氧化活性的重要贡献者。

3 结 论

在3个不同的抗氧化活性评价模型中，丹参根、茎、叶3个部位呈现出了不同的抗氧化活性。其中，丹参叶的醇提物抗氧化活性最强，其还原力、DPPH自由基清除率显著高于根和茎、对PUFA过氧化体系的抑制作用显著高于茎，在预设质量浓度(20mg/mL)下，高于 VC(1mg/mL)；总酚酸物质和总黄酮含量也显著高于其他部位，可作为天然抗氧化剂的来源。

通过对总酚酸、总黄酮与抗氧化活性的相关性分析，其抗氧化活性和总酚酸含量之间存在显著线性相关性，与黄酮类物质含量之间的相关性较差，表明酚酸类成分为其抗氧化活性的重要成分。

目前国内外对丹参叶的研究很少，对化学成分和相关活性的研究也仅停留在成分预试和有效成分含量测定方面。为了更好的开发、利用这一植物资源，对丹参叶中抗氧化酚类物质的提取、分离及各成分间的协同作用和活性有待进一步深入研究。

[1]林琦, 陆金国. 丹参抗动脉粥样硬化的研究进展[J]. 山西中医, 2002, 18(4): 56-58.

[2]PETER M, SIMMONDS M S. Rosmarinic acid[J]. Phytochemistry, 2003, 62(2): 121-125.

[3]黄诒森, 张均田. 丹参中3种水溶性成分的体外抗氧化作用[J]. 药学学报, 1992, 27(2): 96-100.

[4]王新胜, 吴艳芳, 赵瑞娜. 丹参地上部分活性成分TLC分析[J]. 海峡药学, 2007, 19(12): 46-47.

[5]赵爱云, 胡博路, 杭瑚, 等. 部分植物抗氧化活性的初步研究[J]. 天然产物研究与开发, 2000, 12(3): 42-44.

[6]DEWANTO V, WU X, ADOM K K, et al. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity [J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(10): 3010-3014.

[7]SINGLETON V L, ROSSI J A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1965, 16(3): 144-158.

[8]LARRAURI J A, SANCHEZ MORENO C, SAURA-CALIXTO F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J]. Agric Food Chem, 1998, 46 (7): 2694-2697.

[9]YOKOZAWA T, DONG E, NATAGAWA T. in vitro and in vivo Studies on the radical scavenging activity of tea[J]. Agric Food Chem, 1998, 46(6): 2143-2150.

[10]杨怀霞, 马庆一, 许闽. 葡萄籽原花青素的梯度分离及其抗氧化活性研究[J]. 河南中医学院学报, 2004,19(5): 14-16.

[11]郭亚力, 李聪, 欧灵澄, 等. 3种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测[J]. 分析试验室, 2004, 23(10): 43-48.

[12]OYAIZU M. Studies on products of browning reactions: Antioxidative activity of products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44: 307-315.

[13]张尔贤, 方黎, 张捷. 菊花提取物抗氧化活性的研究[J]. 食品科学, 2000, 21(7): 6-8.

[14]CHOI Y, JEONG H S, LEE J. Antioxidant activity of methanolic extracts from some grains consumed in Korea[J]. Food Chemistry, 2007, 103(1): 130-138.

[15]王会, 郭立, 谢文磊. 抗氧化剂抗氧化活性的测定方法(一)[J]. 食品与发酵工业, 2006, 32(3): 92-98.

Antioxidant Activities and Contents of Total Flavonoids and Phenols from Different Parts of Salvia miltiorrhiza Bunge

LI Xin，XUE Zhi-pu，ZHU Wen-xue
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The contents of total phenols and total flavonoids from different parts of Salvia miltiorrhiza Bunge were determined. Antioxidant activities of the extracts from root, leaves and stem of Salvia miltiorrhiza Bunge were evaluated by reducing power on Fe3+, scavenging capability on DPPH free radicals and inhibitory effect on PUFA using vitamin C as the reference. Results indicated that the contents of total phenolic acids and total flavonoids from leaves were significantly higher than those in root and stem. Total phenols in leaves were 1.07 folds and 6.81 folds higher than that of root and stem, respectively. Total flavonoids in leaves were 4.79 folds and 14.5 folds higher than that of root and stem, respectively. Antioxidant activities of ethanol extract from leaves were significantly higher than those of root and stem. The reducing power, scavenging capability on DPPH free radicals and inhibitory effect on PUFA of extracts from Salvia miltiorrhiza were 1.08-, 1.01- folds and 5.78-folds higher than those of vitamin C. A positive correlation was observed between the content of total phenols and antioxidant activities, which demonstrated that the antioxidant activity was related to the content of total phenols.

Salvia miltiorrhiza Bunge；total flavonoids；total phenols；antioxidant activity

Q946.82

A

1002-6630(2011)03-0108-04

2010-06-09

河南科技大学科研创新能力培育基金项目(2009CZ0015)

李欣(1979—)，女，副教授，博士，研究方向为天然产物活性。E-mail：lixinpxy@hotmail.com