唐古特白刺果实提取物抗氧化活性评价

任 旭，陈贵林

唐古特白刺果实提取物抗氧化活性评价

任 旭，陈贵林*

(内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)

采用95%乙醇加热回流提取唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bohr.)果实成分，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取。用DPPH自由基法和ABTS+·法进行抗氧化活性实验，并选取抗坏血酸(VC)和生育酚(VE)作为对照。结果显示乙酸乙酯提取物(EAF)具有较高的抗氧化性，进一步对其进行硅胶柱层析分离，得到6个组分(EAF-Ⅰ～EAF-Ⅵ)，其中EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于VC和VE。白刺果实提取物具有良好的抗氧化性，有进一步开发为天然抗氧化剂的应用前景。

唐古特白刺果实；DPPH自由基；ABTS+·；抗氧化性；分离提取

生物体在代谢过程中产生的氧自由基及其诱导的氧化反应对体内脂类、蛋白质、核酸及糖类等造成的氧化损害是引发炎症、心脑血管疾病及心脏疾病的重要因素[1]。同时，食用油脂、含脂食品和化妆品的酸败变质也与氧自由基氧化有关。常用抗氧化剂大部分是通过工业合成或两步发酵法生产。由于合成抗氧化剂如BHT (3,5-二叔丁基-4-羟基甲基苯)的毒性问题以及消费者对食品安全性意识的提高，亟待从自然界中寻找更加安全且活性更强的天然抗氧化剂。研究表明柿子各部分单宁提取物对·OH、DPPH自由基的清除能力均高于同浓度的葡萄籽提取物[2]，杨梅果核中提取分离到的杨梅素抗氧化活性明显强于BHT[3]。唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)是内蒙古中西部荒漠、半荒漠地区分布的优势种和建群种之一，也是我国特有品种，其果实素有“沙漠樱桃”之美誉。研究表明，新疆地产唐古特白刺果实可抑制高脂血症大鼠血液内异常升高的脂质过氧化物含量[4]，甘肃地产唐古特白刺果汁对小鼠全脑MAO-B活性具有一定的抑制作用[5]，而这些研究结果均基于白刺果实直接饲喂小鼠所得，对于其具有活性的成分并未明确。有关内蒙古地区白刺鲜果中的营养成分已有报道，如氨基酸含量高于沙棘果实2～3倍，糖含量约为沙棘的15%[6]，这与白刺通常生长在盐碱化程度较高的地区密切有关。但是对于白刺果实中具有抗氧化活性的成分仍未见报道。本研究采用系统溶剂法对唐古特白刺果实进行提取，并结合硅胶柱层析进一步分离，以DPPH自由基法和ABTS+·法测定其抗氧化性，以求得到具有较强活性的部位，为开发新型天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白刺果实：2008年7月16日于内蒙古自治区巴彦淖尔市杭锦后旗陕坝镇(北纬40°46′，东经106°47′)采集。经内蒙古大学生命科学学院生物系陈贵林教授鉴定为唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)。经冷冻干燥后，待用。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2-联氮-双-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸))、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)、VE 美国Sigma公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇均为国产分析纯；抗坏血酸 天津光复精细化工研究所；柱层析硅胶(200～300目) 青岛海洋化工集团公司。

1.2 仪器与设备

RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津有限公司；BT2202S电子天平 德国Startorius公司；Modulyod-230冷冻干燥机、Forma -86℃超低温冰箱 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化成分的提取与分离

取白刺果实干质量4.5kg，95%乙醇加热回流法提取(料液比1:5、提取3次、提取时间2、1.5、1h)，抽滤、真空旋转蒸发浓缩得乙醇提取物(CEE)1168.93g。将其分散于水中，依次用石油醚﹑氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂提取3次，分别合并萃取液，抽滤、真空旋转蒸发，分别得到石油醚提取物(PEF) 26.63g、氯仿提取物(CF)25.40g、乙酸乙酯提取物(EAF)44.04g、正丁醇提取物(BF)120.67g、水相(AF) 952.19g。

将所得乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析分离(200～300目)。以石油醚:乙酸乙酯体积比为20:1～1:9，然后乙酸乙酯:甲醇体积比为0:1～1:9梯度洗脱，洗脱液进行薄层层析色谱法(TLC)检测，合并相同馏分，得到6个组分(EAF-Ⅰ～EAF-Ⅵ)，旋转蒸发去除溶剂。

1.3.2 抗氧化活性测定

1.3.2.1 清除DPPH自由基的能力测定

通过测定清除DPPH自由基的能力来测定抗氧化性[7]。25℃恒温水浴反应30min后，在515nm波长处测定吸光度(Ax)，模型对照组(Ao)用无水乙醇代替供试液。考虑到供试液本身的光吸收，用无水乙醇代替DPPH自由基溶液作为无自由基反应的空白对照组(Axo)。每个质量浓度组平行测定3次，取其平均值，测定结果以清除率表示。一般用IC50值，即DPPH自由基的半数清除率，来衡量不同质量浓度的样品间抗氧化性的比较[8]。IC50的计算根据半数效量概率单位法进行。以质量浓度的对数为横坐标，相应质量浓度清除率的概率单位(probit)为纵坐标，求出直线回归方程，并根据方程计算IC50值。DPPH自由基清除率由式(1)计算得出。

1.3.2.2 清除ABTS+·的能力测定

清除ABTS+·的能力测定参考Re等[9]的方法制作出标准曲线y=4.5534x+0.8186(R2=0.9978)。结果用TEAC值表示，即达到一定质量浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度，单位是mol/g[10]。

1.3.3 数据分析

实验数据以SPSS V13.0软件做统计学数据处理，实验结果用x±s表示，多组资料,采用one-way ANOVA分析，组间的比较用Dunnett s检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 唐古特白刺果实不同提取物清除DPPH自由基的能力

图1 DPPH自由基法测定白刺果实不同提取物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of extracts from different parts of N. tangutorum fruits determined by DPPH free radical method

DPPH自由基法测定白刺果实不同部位抗氧化活性是通过DPPH自由基的半数清除率(IC50)来表示的，即IC50值越小，其抗氧化活性越高。由图1可知，乙酸乙酯提取物(EAF)的活性在各提取物部位中最强，但小于VC和VE，其IC50值是VC的53倍，VE的26倍。石油醚提取物(PEF)、氯仿提取物(CF)和正丁醇提取物(BF)之间不存在显著性差异，其中CF的IC50值是VC的68倍和VE的33倍；PEF和BF的IC50值是VC的近100倍，VE的49倍。乙醇提取物(CEE)的抗氧化性显著高于水相(AF)，其IC50值是VC的176倍、VE的87倍。AF的抗氧化性最弱，其IC50值为(143.03±21.59)mg/mL。结果表明，EAF具有较强的清除DPPH自由基的能力，其抗氧化性接近于VE，说明唐古特白刺果实具有开发为新型天然抗氧化剂的潜能。

EAF提取物经柱层析分离所得6个部位的抗氧化活性实验表明，EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化活性最强，均高于VE。其中EAF-Ⅰ的IC50值仅为(0.08±0.03)mg/mL，是VC的24%、VE的12%；EAF-Ⅳ的抗氧化性介于VC和VE之间，其IC50值是VE的86.6%。EAF-Ⅲ、EAF-Ⅴ和EAF-Ⅵ与VC和VE也不存在显著性差异，EAF-Ⅲ的IC50值是VC的39倍、VE的19倍；其中EAF-Ⅴ和EAF-Ⅵ的IC50值几乎相等，是VC的17倍、VE的8倍。EAF-Ⅱ的抗氧化性很弱，其IC50值是VC的99倍、VE的49倍。结果表明，EAF-Ⅰ的抗氧化活性最强，高于常用合成抗氧化剂VC和VE，可作为新型抗氧化剂的原料应用于食品工业。

2.2 唐古特白刺果实不同提取物清除ABTS+·的能力

图2 ABTS+·法测定白刺果实不同提取物的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of extracts from different parts of N. tangutorum fruits determined by ABTS free radical method

由图2可知，EAF的活性在各提取物部位中最强，其抗氧化性略高于VE，其余各提取物以及乙醇提取物的抗氧化性均显著低于EAF、VC和VE。CF的抗氧化性高于其余4个提取物部位，其TEAC值为VC的39.6%和VE的48.1%。CEE、PEF、BF和AF的TEAC值分别是VC的15.4%、16.4%、16.9%和13.6%，VE的18.6%、19.9%、20.5%和16.5%。实验结果与DPPH自由基法测定白刺果实不同部位抗氧化性一致，EAF的抗氧化性与VE相当。

EAF经柱层析分离纯化所得6个部位的抗氧化活性实验表明，EAF-Ⅰ的活性最强，显著高于VC和VE，其抗氧化性是VC的4倍、VE的5倍。EAF-Ⅳ的抗氧化性略高于VC，显著高于VE。其余4个部位的抗氧化性均显著低于VC和VE。EAF-Ⅴ和EAF-Ⅵ之间不存在显著性差异，其TEAC值分别是VC的45.1%和40.1%，VE的54.7%和48.7%。EAF-Ⅱ几乎无活性，TEAC值仅为(1.79±0.97)μmol/g。经过二次分离后所得EAF-Ⅰ的抗氧化性是EAF的近5倍。结果表明，通过柱层析分离，能够得到抗氧化性极强的部位。EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于常用抗氧化剂VC和VE，是很好的天然抗氧化剂，其应用前景非常广阔。

3 结 论

在唐古特白刺果实的乙醇提取物(CEE)、石油醚提取物(PEF)、氯仿提取物(CF)、乙酸乙酯提取物(EAF)、正丁醇提取物(BF)和水相(AF)中，EAF的抗氧化性最强，其清除ABTS+·能力与VC和VE相当。这可能与白刺果实中含有丰富的多酚类活性物质有关。一般认为水果中起抗氧化作用的成分主要是VC，有研究通过对比15种水果的抗氧化活性与VC含量的关系，表明其抗氧化活性与VC含量无明显的相关关系[11]。柿子和莲子壳中含有大量抗氧化成分主要是黄酮类物质[12-13]，小浆果蓝莓中的抗氧化成分主要是多酚类物质[14]，因此抗氧化活性物质大多数集中在乙酸乙酯萃取物。本实验经过二次分离后所得6个组分中，其中EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于VC，但是其余4个部位的抗氧化活性均低于EAF。樱桃化学成分相互影响作用机理的研究[15]表明化学成分之间的互相影响也是很复杂的，因此，寻求具有强抗氧化活性的部位更加具有应用价值。研究结果表明EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于常用合成抗氧化剂VC和VE，这对于开发荒漠野生水果提供了理论依据。因此，唐古特白刺果实提取物作为新型天然抗氧化剂的原料，将在食品工业和化妆品行业中具有广阔的应用前景。

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Antioxidant Activity of Extracts from Nitraria tangutorum Bohr. Fruits

REN Xu，CHEN Gui-lin*
(College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Nitraria tangutorum Bohr. fruits were extracted using 95% ethanol, and then the extract was partitioned with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol successively. The antioxidant activities of different fractions were evaluated by scavenging capability of ABTS+and DPPH free radicals, and compared with the antioxidant activities of ascorbic acid (vitamin C) and tocopherol (vitamin E). Results indicated that ethyl acetate fraction (EAF) exhibited the highest antioxidant activity. EAF was further fractionated into 6 fractions by silica gel column chromatography. The antioxidant activities of EAFI and EAF-IV were higher than those of vitamin C and vitamin E. Therefore, N. tangutorum fruit extracts have excellent antioxidant activities, and have promising application prospects as a natural antioxidant.

Nitraria tangutorum Bohr. fruit；DPPH free radical；ABTS+free radical；antioxidant activity；separation and purification

TS255.1

A

1002-6630(2011)03-0095-03

2010-05-13

国家自然科学基金项目(30660015)；高等学校博士学科点专项科研基金项目(20091501110002)；

内蒙古自治区科技创新引导奖励资金(2010年度)资助项目

任旭(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为药用植物化学。E-mail：rrenxu@163.com

*通信作者：陈贵林(1961—)，男，教授，博士，研究方向为药用植物化学。E-mail：guilinchen@yahoo.com.cn