一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果1)

李保深 高大文 张博

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是人类最宝贵的天然可再生性资源。全世界每年产农作物秸秆近2 000亿t。我国属于农业大国，桔杆年产超过6亿t［1］，大部分作为废弃物被丢弃，不但带来了严重的环境问题，也浪费了宝贵的物质资源。玉米秸秆是纤维素组分含量很高的农作物残留物，如何使玉米秸秆无害化、资源化已经成为国内外研究的热点［2－4］。利用微生物产生的纤维素酶水解秸秆，具有效果稳定及污染少等优点，因而得到了普遍的认可和推崇［5］。因此，筛选和分离出高产纤维素酶的微生物种类，研究其对纤维素物质的降解能力，对减轻农业废弃物给环境的压力和纤维素资源的开发利用具有重要的意义。可降解纤维素的微生物包括真菌、细菌和放线菌，研究较多的有曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)和纤维弧菌属(Cellvibrio)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)等［6］。本研究在大量采集样品的基础上，从自然环境中反复分离筛选，获得了1株具有较高产酶能力和降解活性的菌株，并研究了其对玉米秸秆的降解能力，以期为提高玉米秸秆的利用率提供优质的菌种资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品来源于黑龙江省园艺分院林场腐木土样，东北农业大学校外玉米秸秆腐殖物，哈尔滨市南岗区玉米耕种地土样，东北林业大学林场腐木土样，马家沟东北林业大学段河道内土样，哈尔滨市南岗区玉米耕种地玉米秸秆样品。将玉米秸秆剪成1～2 cm，加入4%的NaOH溶液浸泡24 h，过滤并用沸水洗至中性，在75℃烘干至恒质量，121℃高压蒸汽处理15 min，烘干后待用。用于试验的培养基包括:①初筛培养基。经改良后的察氏培养基，其中以羧甲基纤维素钠(CMC－Na)取代察氏培养基中的蔗糖，其他成分不变。②复筛培养基［7］。CMC－Na 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉10 g/L，定容1 L。③摇瓶发酵培养基［8］。CMC－Na 7.5 g/L，(NH4)2SO44 g/L，蛋白胨5.0 g/L，吐温80 0.18 mL，MgSO43.0 g/L、CaCl23.0 g/L，微量Fe-SO4，自然pH。④玉米秸秆发酵培养基。经碱预处理的玉米秸秆5 g/L代替摇瓶培养基中的CMC－Na，其他成分同摇瓶培养基。

1.2 分析方法

将纯培养菌株接入发酵培养基中，28℃、120 r/min摇床培养7 d，用移液枪吸取1 mL发酵液离心(9 000 r/min，5 min)，上清液即为粗酶液。

酶活力的测定:①滤纸糖化力的测定。取粗酶液0.5 mL，加入醋酸—醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，然后加入一张(1 cm×6 cm)新华1号滤纸，50℃恒温水浴1 h后，立即按DNS法测定还原糖［9－10］(加入3 mL DNS显色液，沸水浴中显色10 min后，快速冷却终止反应，定容至25 mL，540 nm处测定OD值，对比标准曲线计算酶活)。②内切纤维素酶的测定。取粗酶液0.5 mL，加入含1%CMC－Na的醋酸—醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，经50℃恒温水浴30 min后，立即用DNS法测定还原糖。③外切纤维素酶的测定。取粗酶液0.5 mL，加入含2%Avicel的醋酸—醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，50℃恒温水浴2 h，立即按DNS法测定还原糖。④β－葡萄糖苷酶的测定。取粗酶液0.5 mL，加入含0.5%水杨苷的醋酸—醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/L)2 mL，50℃恒温水浴30 min，立即按DNS法测定还原糖。

刚果红染色法:将初筛菌株接种至复筛培养基，培养2～4 d，加入1.0 g/L的刚果红溶液，浸染1 h弃去染液，加入1 mol/L的NaCl溶液，洗涤脱色1 h，测菌落直径(d，cm)和水解圈直径(D，cm)，用D/d表示水解能力。

酶活定义:在反应条件为50℃，pH值4.8下，定义每1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需要的酶量为一个酶活力单位，用IU/mL表示。

菌株的鉴定:①菌株形态鉴定。将获得的菌株接种于平板培养基中，恒温28℃培养2 d，菌体经扫描电镜成像，结合《真菌鉴定手册》［11］和中国真菌志:青霉属及其相关有性型属，从菌株生长特性和形态进行鉴定。②18S rDNA分析。将样品接入摇瓶培养基中，28℃、120 r/min培养3 d，取适量菌株发酵液稀释，封装于10 mL离心管中。真菌18S rDNA通用引物合成和测序由Genscript公司完成。对试验数据进行整理后，运用MEGA3.0构建系统发育树［12］。菌株都快，在第3天即铺满平板，表现出较强的生长和存活能力，因此选定菌株C5作为进一步研究对象。

图1 菌株C5刚果红染色产生的透明圈

表1 真菌水解能力及最高酶活

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌筛选结果

通过对采集的样品进行划线分离、筛选和纯化，得到19株菌株。将获得的真菌进行刚果红染色水解圈的测定，其中有12株真菌产生明显的水解圈，其中，菌株C5产生的水解圈最明显(图1)，D/d=2.948均高于其他菌株产生的水解圈，表明其具有较强的产纤维素酶的能力。

将产生明显水解圈的12株菌株，接入复筛培养基，经DNS法测定滤纸酶活力，最高滤纸酶活力见表1。由表1可以看出，菌株C5和C17的滤纸酶活力高于其他菌株，分别为7.405、6.512 IU/mL，并且其具有较大的刚果红水解圈，其中菌株C5产酶速率较C17快4d，菌株C5在平板上生长较其他

2.2 菌株C5的鉴定

2.2.1 形态学观察

菌株C5在平板培养基上培养2 d，菌落呈圆形，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，呈灰绿色，布满一层分生孢子粉，菌落背面茶棕色(图2(a))。扫描电镜图片显示，菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑，多呈椭圆形或球形(1.0～1.5 μm)，不对称分支2～5个，排列紧密，呈扫帚状(图2(b))，其顶端着生5～10个短小瓶状小梗(10.0～15.0 μm)，呈不分枝的链状(图2(c))。根据菌落形态观察及扫描电镜镜检结果，参照《真菌鉴定手册》和中国真菌志:青霉属，初步判定菌株C5为青霉属(Penicillium sp.)。

图2 真菌C5形态照片

2.2.2 18SrDNA基因序列分析

通过PCR扩增获得菌株C5的ITS序列，大小为1 769 bp，登陆号为HQ455812。将该序列结果输入GenBank以BLAST进行序列同源性比较，结果显示其18S rDNA序列与青霉属(Penicillium sp.)相似性最高，相似度达到99%。运用MEGA3.0构建系统发育树见图3，比例尺为核酸分离度(0.1%)，分支处数字为支持率。结合形态学鉴定结果，确定该菌为斜卧青霉(Penicillium decumbens)。

将菌株C5接入玉米秸秆发酵培养基中，28℃、120 r/min摇床培养，间隔24 h测定菌株C5纤维素酶活，结果见表2。

图3 基于ITS序列同源性菌株C5的系统发育树

表2 菌株C5纤维素酶活力

由表2可知，菌株C5在以玉米秸秆为唯一碳源的培养基中，在28℃、120 r/min的条件下培养至第3天，滤纸酶活最高，为7.085 IU/mL，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β－葡萄糖苷酶最高值分别为3.856、2.681、1.487 IU/mL。

2.3.2 秸秆降解情况

测定酶活结束后，将培养基过滤、风干，取过滤物进行扫描电镜成像试验，观察秸秆样品物理形变，研究真菌C5对玉米秸秆的降解能力。

由图4可知，未处理的玉米秸秆表面光滑，结构紧密，秸秆分布着气孔，因自然风干作用，表面有龟裂现象(图4(a))，经碱预处理后，玉米秸秆复杂的表面结构变得较为清晰，表层的木质素被完全剥离，露出纵向排列的纤维素骨架(图4(b))，根据波尔顿克模型［13］，可以推测纤维素束之间的结构也变得较为疏松，更容易与纤维素酶的活性位点接触。经菌株发酵利用后，纤维素从中间断裂、破碎，结构和性质普遍发生了明显的变化(图4(c))，主要是因为接种菌株在培养过程中利用纤维素进行代谢，导致玉米秸秆纤维素被降解。

2.3 菌株C5秸秆降解效果

2.3.1 纤维素酶活力

图4 不同阶段秸秆样品的扫描照片

3 结论与讨论

在大量采集样品的基础上，从自然环境中分离筛选获得19株菌，进一步筛选得到1株纤维素酶活力高和产酶速率快的菌株C5，经鉴定菌株C5为斜卧青霉菌(Penicillium decumbens)。该菌株具有较全的酶系和较好的产酶能力，对玉米秸秆纤维素有很好的降解效果，培养4 d时滤纸酶活和内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β－葡萄糖苷酶分别为7.085、3.856、2.681、1.487 IU/mL。刘清锋［14］等研究青霉T24－2的产酶特性，在自然pH值下，30℃、130 r/min，发酵4 d该菌株的内切葡聚糖酶和滤纸酶活最高，分别达到45.01、6.89 IU/mL;刘新育［15］等以斜卧青霉A50为试验菌株，添加麸皮7%进行培养，菌株纤维素酶活为19.7 U/mL;刘星斌［16］等利用航天诱变黑曲霉ZM－8菌株固态发酵β－葡萄糖苷酶，培养时间为144 h，获得β－葡萄糖苷酶酶活达到21.74 U/g;艾斌凌［17］等研究麸皮对里氏木霉Rut C－30产纤维素酶的促进作用，获得最高滤纸酶活为6.383 U/mL。本研究获得的斜卧青霉C5在产酶能力和产酶速率方面与已报道的菌株进行比较，其中滤纸酶活和内切葡聚糖酶较高，而外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶较低，主要是因为纤维素酶是一种多酶系，在分解纤维素物质时属于一个协同作用，酶系的后者依靠前者代谢作用的产物进行代谢作用，同时酶系之间还存在着抑制作用，导致外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶较低;斜卧青霉C5在培养第3天即达到产酶高峰期，同已报道的斜卧青霉产酶速率对比有很大的提高。

目前，纤维素降解真菌的研究与应用主要集中于酶系组成比较齐全、产酶量大的木霉属、青霉属、曲霉属等，而青霉属具有生长快和易培养的优势。因此，青霉属具有很高的潜力和价值应用于纤维素的降解，并被众多学者用于降解纤维素的研究。已报道产纤维素降解酶系的青霉菌株，以斜卧青霉、绳状青霉(Penicillium funiculosum)和微紫青霉(Penicillium janthinellum)等菌株的产酶能力最强［18－19］。也有关于草酸青霉产酶的报告，但酶活力不高［20］。

斜卧青霉C5是本研究获得的纤维素酶活力最强的菌株，其酶活力和产酶速率均较高，而且拥有较完整的纤维素酶系，在降解玉米秸秆的过程中表现出较强的水解能力，菌株C5是一株具有研究和开发潜力的菌株。

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