基于 T型套管瘘术的鸡小肠食糜流量变异规律的研究

张建智 赵 峰 张宏福 王洪荣

在家禽体外模拟消化技术的研究中,首先需要阐明肠道的代谢规律。然而家禽的肠道较细,腹腔狭小,文献报道的家禽肠道消化液组成参数多通过屠宰取食糜的方法从死禽体内获得,所得信息的可靠性差。因此,如何解决在可大量获取有代表性肠道食糜后研究小肠各段食糜的特性,对体外模拟消化过程的建立非常重要。自 20世纪 50年代以来,人们在禽用肠道套管的研制上进行了许多尝试,Dixon等[1]利用结肠造口术测定了鸡饲料消化能,Johns等[2]利用回肠套管测定了鸡回肠氨基酸消化率。然而,这些研究多是采用玻璃管或 1 mL硬质塑料注射器作为套管,经常出现套管脱落或滑入腹腔,食糜在套管管型部干涸、堵塞及自泌样品无法低温保鲜等一系列问题。近年来,本研究组所在的动物营养学国家重点实验室分别从禽用套管、套管塞、采样瓶、荷术外科手术等几个方面进行了系统研究[3],并申报了禽用肠道套管的国家专利(专利申请号:zl201020257424.3;zl201030236703.7)。这为大量获取家禽肠道消化生理信息的基础参数提供了创新手段。通过该套管技术,本实验室曾以北京鸭为试验动物,系统研究了鸭肠液中主要消化酶活性的昼夜变异规律及饲粮营养水平对肠液组成的影响[4-5]。然而,在小肠消化特性的研究上,鸡和鸭在体重、肠道尺寸上存在着较大的差异,且不同肠段食糜的流量也有各自的特性,该套管技术是否适合于鸡小肠消化生理的研究,通过肠道套管所获得的十二指肠、空肠、回肠食糜有哪些特性等问题仍有待深入研究。为此,本试验选用在代谢能测定中常用的成年蛋公鸡为试验动物,分别在十二指肠、空肠、回肠安装 T型套管,通过观察试验鸡术后的健康状况及各肠段食糜、食糜干物质、肠液、肠液总蛋白流量的日内变异和日间变异,探讨基于 T型套管瘘术的鸡肠道各段食糜的基本生物学特性,从而为鸡体外模拟消化方法的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及套管安装

选择 18周龄健康、体重基本一致[平均体重为(2.30±0.19)kg]的成年海兰褐佳蛋公鸡114只,随机分为 3组,每组 38只。根据本实验室禽用 T型套管安装方法[3],分别在试验鸡十二指肠、空肠、回肠安装套管。其中十二指肠套管安装在 U形弯曲段的大弯处,空肠套管安装在卵黄囊憩室附近 2 cm范围内,回肠套管安装在距回盲结合部约 10 cm处。最终安装 T型套管荷术鸡 110只,其中十二指肠、空肠、回肠荷术鸡分别为 35、38和 37只。

术前绝食 24 h,术后试验鸡放于代谢笼单笼饲养,禁饲 3 d,自由饮水。每只鸡每日护理 3次:口服青霉素 20万单位、链霉素 5万单位,灌服补液(0.9%NaCl、10%葡萄糖各 30 mL),并用碘酊、酒精棉擦拭术部。集中护理 3 d,第 4天、第 5天开始限饲(15 g/只),以后每日的限饲量在前 1天基础上增加 15 g,直至术后 10 d左右恢复自由采食(110 g/只)。第 10天开始拆线并去掉套管垫圈。术后 15 d荷术鸡自由采食玉米 -豆粕型饲粮(表 1),饲养管理按照动物营养学国家重点实验室的常规程序进行。

1.2 试验设计

采用 3×6完全随机设计,其中采样日期设 3个处理,即术后第 31天、第 34天、第 37天采样。日内采样时间设 6个处理,即采样日内的 09:30—10:30、13:30—14:30、 17:30— 18:30、 21:30—22:30、01:30— 02:30、05:30— 06:30,通过套管收集 1 h肠道食糜样品。待荷术鸡经过 20 d的恢复期后,分别从 3组健康荷术鸡(十二指肠荷术鸡 35只,空肠荷术鸡 32只,回肠荷术鸡 33只)中各随机选择 15只,分为 5个重复,每个重复 3只鸡。根据两因素完全随机设计方案分配到每个处理中。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis) %

1.3 样品制备及测定指标

每次准确收集 1 h食糜样品后,测定食糜的体积并称重。同时,取上清液 6～12 mL,分装于1.5 mL离心管中,于 -20℃保存。剩余食糜转入培养皿,放入烘箱,先 65℃烘 12 h,然后 105℃烘4 h,测食糜绝干重。

将保存的食糜上清液在 4℃﹑ 1 250×g条件下离心 10 min,离心结束后于 40℃水浴锅恒温加热 3 min,并吸取 1 mL测定肠液比重,同时根据肠液比重计算肠液的体积。计算公式如下:

肠液总重(g/h)=食糜总重(g/h)-食糜干物质总重(g/h);

肠液流量(mL/h)=肠液总重(g/h)/肠液比重(g/mL);

肠液总蛋白流量(mg/h)=肠液总蛋白含量(mg/mL)×肠液流量(mL/h);

食糜干物质含量(g/mL)=食糜干物质流量(g/h)/食糜流量 (mL/h)。

肠液总蛋白含量采用南京建成生物工程研究所提供的考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(人份:100T;批号:20101015)测定。

1.4 统计分析

统计学检验利用 SAS 9.1[6]软件 ANOVA模块对术后体重进行方差分析。

统计模型为:Yij=μ+Wi+ξij。

式中,μ为总体平均值,W为体重,ξij为随机误差项。

利用 SAS 9.1[6]软件的 UNIVARIATE、ANOVA程序分别对各处理间的数据进行正态性与方差齐次性检验。

采用 3×6完全随机模型进行统计分析,模型为:

式中,μ为总体平均值,D为日期,T为时间效应,ξijk为随机误差项。

试验数据以平均值 ±标准误表示,均值多重比较采用 Duncan氏法进行,显著水平为 P＜0.05。

2 结 果

2.1 T型肠道套管荷术鸡的健康状况及术后体重的恢复

荷术鸡在 1周内恢复采食,术部完全愈合。术后 1周内荷术鸡主要表现为体重下降、鸡冠暗红、粪便稀少。而在随后 1周内荷术鸡鸡冠鲜红、羽毛整齐清洁、粪便呈现灰色或灰褐色。恢复期内有少数试验鸡喜好啄食术部及套管,伤口经多次清洗、消毒护理后 15 d内都能恢复到良好的状态(表 2)。除个别荷术鸡出现套管脱落、眼疾、抓鸡应激等情况死亡外,其余荷术鸡在术后 4个月内都健康、正常。术后 120 d时,十二指肠、空肠、回肠荷术鸡健康的比例分别达到 80%、76%、81%。卡方检验表明,肠段不同部位安装 T型套管,3组荷术鸡间的手术成功率无显著性差异(Х2=0.87,P＞0.05)。从试验鸡术后体重的恢复情况看,术后 20 d内 3组荷术鸡的体重均呈现先下降然后逐渐恢复的变化。其中,十二指肠与回肠荷术鸡在术后 20 d可恢复到术前体重,空肠荷术鸡在术后 25 d也可恢复到术前体重。术后120 d,荷术鸡的体重在术前体重的基础上有显著增加(P＜0.05)。此外,经统计分析,3组不同部位安装套管的荷术鸡在术后 10、20、25、120 d的体重上无显著差异(P＞0.05)。

2.2 鸡肠道不同位点套管内自泌食糜及食糜干物质流量的日内及日间变异

从鸡小肠不同位点(十二指肠、空肠、回肠)套管内食糜及食糜干物质流量(3 d流量的平均值)的差异看(表 3),十二指肠食糜的流量最大,约为空肠食糜流量的 3.3倍,回肠食糜流量的 4.3倍。十二指肠食糜的干物质含量与干物质流量也最高,其中干物质含量约为空肠食糜的 1.4倍,回肠食糜的 1.6倍;干物质流量约为空肠食糜的 5.0倍,回肠食糜的 7.6倍。在不同肠段食糜及干物质流量变异幅度的差异上,十二指肠中食糜流量的日内和日间变异系数约为空肠食糜流量相应变异系数的 2.3倍,回肠食糜流量的 1.6～3.3倍。十二指肠食糜干物质流量的日内和日间变异系数约为空肠食糜干物质流量相应变异系数的 1.9倍,回肠食糜干物质流量相应变异系数的 2.4～4.3倍。

从肠道食糜及干物质流量的日内变异看,十二指肠食糜及干物质流量在 3 d的采样期内均呈现随昼夜交替而逐步下降的变异规律,09:30—10:30的食糜流量显著高于其他时间段食糜流量(P＜0.05),13:30—22:30食糜流量相对稳定,各时间段之间差异不显著(P＞0.05),随后呈现出下降规律,在 05:30—06:30达到最低值,显著低于其他时间段(P＜0.05);而食糜干物质的流量在09:30— 10:30最高 (P＜0.05),在 13:30— 18:30干物质流量显著地降低到一个较低的平台期(P＜0.05),然后在 21:30—次日 06:30再次显著地降低到一个更低的平台期(P＜0.05)。在空肠食糜及干物质流量的日内变异上,09:30—14:30食糜流量呈现一个较高流量的平台期,然后逐渐下降并在 21:30—次日 06:30达到一个新的较低流量的平台期;而食糜干物质的流量在01:30—02:30达到最低值,显著低于 09:30—14:30食糜干物质流量(P＜0.05),而 21:30—次日 06:30食糜干物质流量无显著性变化(P＞0.05)。在回肠食糜及干物质流量的日内变异上,09:30—10:30的食糜流量与 01:30—06:30的食糜流量无显著差异(P＞0.05),但显著地低于13:30—18:30的食糜流量(P＜0.05),而 21:30—22:30的流量最低,显著地低于其他时间段的食糜流量(P＜0.05);食糜干物质流量在 13:30—18:30最高,21:30—次日10:30食糜干物质流量无显著性变化(P＞0.05)。

表2 术后荷术鸡的健康状况Table 2 Health status of cockerels after operation

在肠道食糜及干物质流量的日间变异上,十二指肠食糜在 3 d采样期内平均每小时的流量随采样日期延后依次显著降低(P＜0.05),其食糜干物质在第 3天采样期内的平均流量显著低于前 2天采样期内的平均流量(P＜0.05)。而空肠食糜在第 1天采样期内的平均流量显著地高于其他 2 d的平均流量(P＜0.05),而后 2天的平均流量无显著性差异(P＞0.05),其食糜干物质在第 3天和第 1天采样期内的平均流量差异显著(P＜0.05)。回肠食糜流量及食糜干物质流量 1 d内每小时的平均流量在3 d采样日期内均无显著差异(P＞0.05)。

2.3 鸡肠道不同位点套管内自泌肠液及肠液总蛋白流量的日内及日间变异

从鸡小肠不同位点套管内肠液及肠液总蛋白流量(3 d流量的平均值)的差异看(表4),十二指肠肠液的流量最大,约为空肠肠液流量的 3.3倍,回肠肠液流量的 4.3倍。而空肠肠液总蛋白含量及流量最高,其中,肠液总蛋白含量约为十二指肠肠液总蛋白含量的 3.9倍,回肠肠液总蛋白含量的 1.6倍,流量约为十二指肠肠液总蛋白流量的 1.3倍,回肠肠液总蛋白流量的 2.1倍。在不同肠段小肠肠液及肠液蛋白流量变异幅度的差异上,十二指肠肠液流量的日内及日间变异最大,两者均约为空肠肠液流量的 2.2倍,而日内变异约为回肠肠液流量的 1.6倍,日间变异为回肠肠液流量的 2.9倍。从肠液总蛋白流量看,十二指肠和空肠肠液总蛋白流量的日内变异相差不大,且都比回肠肠液总蛋白流量的日内变异大。空肠肠液总蛋白流量的日间变异最大,约为十二指肠肠液总蛋白流量的 5.1倍,回肠肠液总蛋白流量的 1.6倍。

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从小肠肠液及肠液蛋白流量的日内变异看,十二指肠肠液流量在测定平均值上随昼夜变化呈现先降后升再降的变异规律,且 3 d采样期内这种规律保持一致。但通过对 3 d测值的统计分析表明,09:30—次日 6:30,十二指肠肠液流量在 09:30—10:30的流量最大,显著地高于其他时间的流量(P＜0.05);同时,01:30—02:30十二指肠肠液的流量显著地高于 05:30—06:30流量的相应值(P＜0.05)。十二指肠肠液总蛋白的流量在 09:30—18:30处于较高的平台期,在 21:30—次日 06:30处于一个相对较低的平台期。空肠肠液流量在09:30—14:30呈现一个较高的平台期,然后逐渐下降,并在 21:30—次日 06:30达到一个新的较低的平台期;而空肠肠液总蛋白流量在09:30—14:30最高(P＜0.05),然后在 17:30—次日 06:30下降到一个相对稳定的水平。回肠肠液在 09:30—10:30的流量与 01:30—06:30的流量无显著差异 (P＞0.05),显著地高于 21:30—22:30的流量(P＜0.05),但显著地低于 13:30—18:30的流量(P＜0.05);而回肠肠液总蛋白的流量却呈现先下降后回升的变化规律。

从小肠肠液及肠液蛋白流量的日间变异看,十二指肠肠液在 3 d采样期内平均每小时的流量随采样日期延后依次显著降低(P＜0.05),而肠液总蛋白的流量在 3 d采样期间无显著差异(P＞0.05)。空肠肠液在第 1天采样期内的平均流量显著地高于其他 2 d的平均流量(P＜0.05),后2天的平均流量无显著性差异(P＞0.05),而肠液总蛋白流量在第1天和第 2天采样期内的平均流量差异不显著(P＞0.05),但显著地高于第 3天的平均流量(P＜0.05)。回肠肠液及肠液总蛋白流量 1 d内每小时的平均流量在 3 d采样期内均无显著差异(P＞0.05)。

3 讨 论

3.1 肠道套管荷术鸡适宜恢复期及应用时限的探讨

肠道套管安装过程需要依次切开皮肤层、肌膜、横斜肌肉层、腹膜及气囊膜,然后进入腹腔,并在背向肠系膜的一侧做套管安装切口。因此,整个术部的创伤较大。从国内外报道的鸡、猪、牛等家畜肠道套管手术的术后恢复期上多规定为 2～21 d不等(表 5),但鲜见关于确定恢复期的依据。而在应用时限上,也鲜见关于套管瘘术鸡、猪、牛术后可利用年限的详细数据。本试验中,荷术鸡的术后恢复及应用时限主要从体况恢复、术后淘汰原因、采食量、精神状态、羽毛、排泄物状态与颜色方面进行考察。根据考察结果可发现,荷术鸡经 20～25 d可恢复至术前的健康水平。在荷术鸡的使用时限上,术鸡经过 4个月的试验后,体重在术前的基础上显著增加。同时,可保持 80%左右的术鸡在经历了“不同能蛋比饲粮对肠液组成成分影响的研究”的食糜采集试验后仍保持健康体况。由此可见,肠道套管瘘术在鸡小肠消化生理研究上的应用时限在 4个月以上。

表5 套管瘘术在畜禽消化生理研究中的应用Table 5 Application of cannulation in livestock and poultry

3.2 鸡肠道中食糜及肠液流量的特性

成年蛋公鸡的小肠全长 1.2～1.4 m,肠道沿纵向长度在组织形态、食糜停留时间、消化液分泌速度等方面都存在显著差异。由此导致了肠道不同肠段的食糜及干物质流量、肠液及肠液总蛋白流量不仅沿肠道的纵向分布上存在差异,而且在昼夜节律上也有变异。本试验中,十二指肠的食糜、食糜干物质、肠液流量都大大高于空肠和回肠的相应流量,这主要是由于沿着小肠纵向长度,摄入的饲粮逐渐被消化,饮水及内源性消化液也逐渐被吸收,从而使得十二指肠、空肠、回肠的食糜、食糜干物质及肠液流量依次降低。该结果与本研究组在前期试验中观察的结果[15]一致。在食糜的干物质含量上,通过套管收集到的十二指肠、空肠和回肠的食糜干物质含量分别为 6.9%、4.8%、4.3%(表 4),该结果与张铁鹰[16]通过屠宰法获取的肉仔鸡十二指肠、空肠、回肠食糜的干物质含量约为 20%相比较有较大的差异,这可能与试验方法及采样部位有关。本试验表明,在鸡肠道不同位点食糜、食糜干物质、肠液及肠液总蛋白流量的日内变异及日间变异上,总体呈现白天流量大、夜间流量小的变异规律,而且在日间的平均流量上也存在差异。该结果与本实验室前期在北京鸭肠液中主要消化酶活性昼夜及日间变异规律的结果[5]类似,这种昼夜变异的主要原因可能与自然光照、自由采食条件下鸡的日采食量主要分布在白天有关[17-20]。而在不同采样日间也存在某些差异,这可能是试验动物每天的生理状态存在某些差异,从而反映在食糜的特性上也存在日间差异,这一特性与大量消化试验中猪、牛粪样或肠道食糜样品常规养分或指示剂浓度存在日间差异[21]类似。

4 结 论

①在鸡十二指肠、空肠、回肠安装套管术后25 d可恢复到术前体重,术后 120 d,试验鸡健康正常的比例分别达到 80%、76%和 81%。

②在自由采食、自然光照条件下,鸡十二指肠、空肠、回肠在食糜、食糜干物质、肠液及肠液总蛋白流量上呈现白天流量大、夜间流量小的变异规律,日内变异系数在 6.28%～43.02%。在日间的平均流量上也存在显著性差异,日间变异系数在 1.25%～16.40%。

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