通过花粉管通道法导入红树总DNA获得耐盐紫花苜蓿T0代植株及其RAPD验证

张立全,牛一丁,郝金凤,哈斯阿古拉

(内蒙古大学生命科学学院内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室,内蒙古 呼和浩特010021)

土壤盐碱化是一个世界性的问题,培育抗盐转基因作物新品种,充分利用盐碱地,具有重要意义[1]。利用转基因技术进行育种即可以有效地打破物种界限,又可达到定向改良植物的目的[2]。然而,植物的耐盐性是多种耐盐代谢、生理过程综合表现的结果,受多个基因控制[3]。因此,培育转基因耐盐植物时,转移单个基因往往只能获得部分耐盐性。为了获得具有应用价值的耐盐植物品种,可能需要直接转移耐盐供体基因组DNA,花粉管通道法(pollen-tube pathway)[4]转基因技术的创建使其成为可能。利用盐生植物DNA直接导入受体来培育耐盐植物已有许多成功的报道。林栖凤等[5-8]开展了耐盐作物分子育种研究,将海岸盐生植物红树(Rhizophora apiculata)DNA 导入番茄(Lycopersicon esculentum)[5]、豇豆(Vigna sesquipedalis)[6]、茄子(Solanum melongena)[7]、辣椒(Capsicum annuum)[8],获得了耐盐能力明显增强的变异后代。肖军等[9]将碱蓬(Suaeda salsa)总DNA导入番茄,获得了抗盐植株。以上研究证实直接转移供体基因组DNA进行作物耐盐性育种是可行的。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面积最大的优质豆科牧草[10,11],而利用基因工程技术来提高苜蓿抗寒、抗旱、耐盐碱能力以及改良其营养品质已成为苜蓿发展和研究的新趋势和重点[12]。张改娜和贾敬芬[13]将豌豆清蛋白1(PA1)基因转入紫花苜蓿,结果显示转PA1基因再生植株中蛋氨酸和半胱氨酸的含量提高4倍。Winicov和Bastola[14]将转录因子基因Aflin1导入苜蓿,超表达Af lin1的愈伤组织可抵抗171 mmol/L NaCl的胁迫作用。燕丽萍等[15]对转BADH基因T1代苜蓿的抗盐性进行了研究,结果表明转基因植株的耐盐性明显高于对照。以上研究均是利用农杆菌介导法,而且导入的均是单一基因,有关导入基因组DNA来培育苜蓿新品种尚未见相关报道。

本研究利用花粉管通道法,将盐生植物红树总DNA直接导入紫花苜蓿,对获得的T0代植株进行耐盐性筛选和随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分子鉴定,旨在为紫花苜蓿耐盐育种提供新的种质材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供体:盐生植物红树采自深圳市红树海滨生态公园。

受体:紫花苜蓿阿尔冈金(Algonguin)品种,种子由中国农业科学院草原研究所于林清研究员提供,2005年种植于内蒙古大学生命科学学院花房试验田。

1.2 方法

1.2.1 外源DNA的导入 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法[16]提取红树总DNA,用 TE缓冲液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH8.0)回溶,0.1×SSC(1×SSC:150 mmol/L氯化钠,15 mmol/L柠檬酸钠)稀释至终浓度为250 ng/μ L,-20℃冻存备用。2007年6月和2008年6月连续2年的盛花期,在晴天上午8时选择当天新开放的花朵,人工辅助异花授粉。授粉后24 h时切去1/2柱头,用微量进样器在柱头切口处滴加5 μ L红树DNA溶液,共导入1 391朵,按常规方法进行栽培管理,荚果成熟时采摘收集T0代转化种子。

1.2.2 T0代植株的盐胁迫筛选 取未转基因种子,砂纸轻轻打磨,70%酒精表面消毒10 min后,0.1%的升汞消毒10 min,无菌水冲洗4～5次,播种在NaCl浓度为0,50,75,100,125,150,175,200,225和250 mmol/L的MS培养基上,每个培养皿播种20粒种子,重复3次。培养2周后,统计发芽率。取T0代转化种子,表面消毒后种植在含225 mmol/L NaCl的MS培养基上,培养2周后,将正常发芽且生长主根和真叶的植株移栽至不含NaCl的MS培养基上,培养3周,移栽至花盆,获得耐盐 T0代植株。

1.2.3 耐盐性 T0代植株RAPD分析 取耐盐性T0代植株叶片,采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate,SDS)法提取DNA[17]。选用上海生工生物工程公司S编号的随机引物55条,以红树DNA和未转化紫花苜蓿DNA为模板,选出扩增产物清晰、稳定的引物,对耐盐性T0代植株DNA样品进行RAPD分析。PCR反应体系 25 μ L:10 ×缓冲液 2.5 μ L,MgCl2(25 mmol/L)2.0 μ L,dNTP(各 2.5 mmol/L)2.0 μ L,引物(5 pmol/μ L)2.0 μ L,DNA 模板 100 ng,Taq 酶(5 U/μ L)0.3 μ L,补蒸馏水至25 μ L。PCR 反应条件 :95 ℃预变性 5 min;95℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸2 min,45个循环;72℃延伸7 min。PCR产物在3.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析,溴化乙锭染色后用凝胶成像仪观察结果并拍照。试验设2次重复。

2 结果与分析

2.1 T0代种子的获得

2007和2008年2年共导入1 391朵花,获得荚果445个,收集饱满种子894粒,结荚率为32.0%,结籽率为2.01粒/荚。

2.2 T0代植株耐盐性筛选

未转基因种子在含0,50,75,100,125,150,175,200,225,250 mmol/L NaCl的MS培养基上种子发芽率分别为95.0%(图1A),90.0%,85.0%,70.0%,47.5%,30.0%,22.5%,12.5%,0(图 1B),0,即225 mmol/L 的NaCl浓度是筛选耐盐性种子的适合浓度。

图1 225 mmol/L NaCl筛选T0代植株Fig.1 T0seedlings selected by 225 mmol/L NaCl

将收获的894粒T0代种子播种在含225 mmol/L NaCl的MS培养基上。培养2周后,有12粒正常发芽,且长有发育良好的真叶、主根和侧根(图1C)。移栽至不含NaCl的MS培养基上,培养3周,移栽至花盆,获得耐盐性 T0代植株,编号分别为:Ms-ra1～Ms-ra12。

2.3 RAPD分析

选用55条 RAPD引物对供体和受体基因组DNA进行PCR扩增,筛选得到清晰扩增产物、重复性好的8条引物(表1)。利用选定的8条引物对12株T0代植株进行RAPD分析,同时以供体DNA和受体DNA作对照。观测所有的扩增电泳条带,8条引物扩增出36条条带,扩增产物分子量为0.17～2.50 kb(图2)。多态性主要表现为供体和受体均没有的新增条带、供体特异条带、受体条带丢失3种情况(表2)。

表1 RAPD引物序列Table 1 Sequences of RAPD primers

图2 RAPD分析图谱Fig.2 The patterns of RAPD analysis

所获得的12株植株均有大小不等的供体特异条带出现(图2,表2),S178引物在5个植株(Ms-ra3、Ms-ra6、Ms-ra8、Ms-ra11、Ms-ra12)中出现供体特异条带,大小约 0.7和0.9 kb。S198在4个植株(Ms-ra1、Ms-ra5、Msra6、Ms-ra11)中均有供体特异条带的出现,大小约为0.90 kb;S180在植株Ms-ra5和Ms-ra6中均出现了2条供体特异条带,大小约为0.55和0.65 kb,而在植株Ms-ra2、Ms-ra4和Ms-ra11中也有约0.65 kb的供体特异条带出现;S144在所有植株中都有约0.45 kb大小的供体特异条带。除Ms-ra6、Ms-ra7、Ms-ra10和Ms-ra11外,其余均出现了供体和受体都没有的新增条带。S198在 5个植株(Ms-ra3、Ms-ra4、Ms-ra5、Ms-ra11、Ms-ra12)中出现了新增条带,而有4个引物(S67、S105、S180、S144)在植株Ms-ra2中出现了新增条带。同时,各植株均有受体条带丢失现象,其中引物S178在所有转化植株中都丢失约1.20 kb的受体条带,S1407在各转化植株中的受体条带丢失现象更为明显。

表2 RAPD多态性分析Table 2 The polymorphisms of RAPD analysis

3 讨论

本研究以红树总DNA为供体,利用花粉管通道法获得了紫花苜蓿耐盐新种质,在225 mmol/L NaCl胁迫条件下,获得12株正常生长的植株,而未转基因种子在225 mmol/L NaCl胁迫时,不能正常发芽,表明已获得了比对照耐盐性显著增强的T0代植株。

以PCR为基础的RAPD技术可以检测基因组上的微小差异[18],因此,RAPD技术已成为验证外源DNA是否导入受体的有效手段,并有许多研究得到了证实[8,19,20]。本研究RAPD结果显示,12个T0代耐盐植株大多数条带与受体一致,但也明显出现有供体的特异条带,表明已有外源DNA导入并整合到受体基因组中。由于外源DNA的导入并整合在受体基因组中,导致了后代基因组DNA在一级结构上发生改变,可能会改变导入后代基因组某些片段的引物结合位点,从而会导致新的DNA条带出现或受体原有条带丢失。这些结果表明供体红树DNA已整合在所获得的12株耐盐植株基因组中。

[1］赵可夫,李法曾.中国盐生植物[M].北京:科学出版社,1999.

[2］崔润丽,刁现民.植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展[J].中国生物工程杂志,2005,25(8):25-29.

[3］Mccuc K F,Hanson A D.Drought and salt tolerance:Towards understanding and application[J].T rends in Biotechnology,2000,8:358-362.

[4］Zhou G Y,Weng J,Zeng Y,et al.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos[J].Methods in Enzymology,1983,101:433-481.

[5］林栖凤,方清,邓用川,等.耐盐番茄分子育种研究[J].生命的化学,2004,24:35-37.

[6］林栖凤,邓用川,李冠一,等.外源DNA导入豇豆提高耐盐能力的研究[J].生物化学杂志,1997,10:454-455.

[7］林栖凤,邓用川,李冠一,等.红树DNA导入茄子获得耐盐性后代的研究[J].生物工程进展,2001,21(5):40-44.

[8］林栖凤,邓用川,吴多桂,等.耐盐辣椒分子育种[J].生物工程进展,1999,19(5):19-24.

[9］肖军,张立军,任志莹,等.通过花粉管通道导入外源DNA获得抗盐番茄新品系[J].沈阳农业大学学报,2008,39(3):362-364.

[10］耿华珠,吴永敷,曹致中,等.中国苜蓿(第一版)[M].北京:中国农业出版社,1995.

[11］马春晖,夏艳军,韩军,等.不同青贮添加剂对紫花苜蓿青贮品质的影响[J].草业学报,2010,19(1):128-133.

[12］刘青芳,步怀宇,赵宇玮,等.紫花苜蓿离体培养植株再生及其RAPD分析[J].草业学报,2006,15(5):115-121.

[13］张改娜,贾敬芬.豌豆清蛋白1(AP1)基因的克隆及对苜蓿的转化[J].草业学报,2009,18(3):117-125.

[14］Winicov I,Bastola D R.Transgenic overexpression of the transcription factor Alfin1 enhances expression of the endogenous M sPRP2 gene in Alfalfa and improves salinity tolerance of the plants[J].Plant Physiology,1999,120:473-480.

[15］燕丽萍,夏阳,梁慧敏,等.转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究[J].草业学报,2009,18(6):65-71.

[16］吴多桂,林栖凤,李冠一.红树DNA的CTAB法提取及其RAPD反应[J].中国生物化学及分子生物学报,1999,15(1):67-70.

[17］王关林,方宏筠.植物基因工程(第二版)[M].北京:科学出版社,2002.

[18］Atienzar F A,Jha A N.The random amplified polymorphic DNA(RAPD)assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies:A critical review[J].Mutation Research,2006,613:76-102.

[19］王松文,赵炳然,邢全华,等.野生稻DNA片段存在于高世代水稻变异系进一步的分子验证[J].中国农业科学,2006,39(11):2170-2177.

[20］李希臣,雷勃钧,卢翠华,等.早熟大豆外源DNA导入的RAPD分子验证[J].大豆科学,1994,13(2):152-156.