脐带间充质干细胞输注治疗顽固性溃疡性结肠炎

刘 静 韩冬梅 薛 梅 朱 玲 王志东 闫洪敏 郭子宽 王恒湘

脐带间充质干细胞输注治疗顽固性溃疡性结肠炎

刘 静 韩冬梅 薛 梅 朱 玲 王志东 闫洪敏 郭子宽 王恒湘

目的 探讨脐带间充质干细胞输注治疗顽固性溃疡性结肠炎的疗效。方法 对1例顽固性溃疡性结肠炎患者采用脐带来源的间充质干细胞静脉输注，每周1次，剂量为（1．5～1．8）×106cells/Kg，4周为一个疗程，共两个疗程。流式细胞仪分别检测治疗前后外周血免疫细胞的比例变化。结果 两个疗程后，患者腹痛及顽固性腹泻消失，外周血中CD4＋/CD8＋细胞比例略有增加。结论 间充质干细胞输注治疗溃疡性结肠炎是安全的，这种新型疗法可能是治疗顽固性溃疡性结肠炎的一个合适选择。

间充质干细胞 溃疡性结肠炎 输注

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一类反复发作的慢性非特异性肠道炎症性疾病。确切病因和发病机制尚不清楚，可能是遗传易感者在环境因素和肠道菌群作用下，免疫和炎症反应失调所致。氨基水杨酸类药物、皮质激素、免疫抑制剂是目前治疗溃疡性结肠炎的主要方法，这些非特异性抗炎和免疫抑制药物，只能暂时控制和缓解症状，不能从根本上治愈该病，且长期应用不良反应增多，停药后易复发（1年复发率大于50%）。部分对激素产生耐药性的顽固性患者效果更差，严重危害健康。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）具有调节免疫、促进黏膜修复的功能[1]。我院率先采用脐带间充质干细胞静脉输注治疗1例顽固性UC患者，疗效较好。

1 病例资料

患者，男，25岁，2007年6月开始，出现无明显诱因的中上腹、左下腹隐痛不适，脓血便，2～3次/日，给予柳氮磺嘧啶，上述症状有所减轻。2008年7月，上述症状加重，频繁脓血便，每日10余次，伴有剧烈腹痛，无发热、恶心、呕吐，再次就诊，行肠镜检查示“全结肠黏膜弥漫性充血水肿，散在点片状糜烂溃疡”，诊断为溃疡性结肠炎。给予5-氨基水杨酸、强的松等药物治疗，强的松最大量为60 mg/d，病情控制后减量至30 mg/d，但减量后病情反复。2009年3月，病情再次加重，症状同前，将强的松改为强的松龙，起始60 mg/d，症状控制后逐渐减至25 mg/d，但减量后病情亦反复。之后长期给予强的松龙25 mg/d、5-氨基水杨酸4 g/d、硫唑嘌呤100 mg/d。患者长期腹痛，大便3次/日，脓血便，体重下降。2009年3月，2009年8月和2010年1月，结肠镜检查均提示“溃疡性结肠炎（全结肠）”。2010年1月入我院，查体：消瘦，精神差，中上腹及左下腹部压痛，肠鸣音亢进，余未见异常。诊断：溃疡性结肠炎（全结肠），活动期，中度，慢性持续型。

2 治疗方法

2.1 脐带间充质干细胞制备

按文献方法稍加改良后进行脐带间充质干细胞（Umbilical cord MSC，UC-MSC）制备[2]。即，经知情同意及感染源检定后收集脐带，去除外膜和动静脉，将脐带剪成0．5 cm3大小组织块，加入等体积0．2%Ⅰ型胶原酶，37℃消化过夜。次日，加入两倍体积的0．05%胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min离心10 min收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于hMSC无血清培养基（杭州百威公司）中，按1×106cells/cm2的密度接种于塑料培养瓶中。1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0．05%胰蛋白酶消化，按6 000 cells/cm2的密度接种细胞，并进行传代培养。常规感染源检定后，收集第3代细胞用于治疗。

2.2 流式细胞仪细胞表型分析

收集 MSC，分别加入 PE标记的小鼠抗人PDGF-R、CD31、CD44、CD45和CD73单克隆抗体（BD公司，美国），室温避光反应20 min后，PBS洗涤。在治疗前及治疗1周后采集患者外周血，分别加入 PE或 FITC标记的小鼠抗人 CD3、CD4、CD8、CD19、CD56以及Per-cep标记的CD45单克隆抗体，反应同前。BD Calibur（BD公司，美国）收集数据，WinMdi-2．9软件分析结果。

2.3 细胞治疗

采用静脉输注。首疗程：UC-MSC 1．5×106cells/Kg每次（8×107个/次）；次疗程：UC-MSC 1．8×106cells/Kg每次（1×108个/次）。每疗程均治疗4周，每周注射1次。

3 结果

3.1 UC-MSC的鉴定

收集MSC进行表型分析，细胞均一表达CD73（间充质细胞标记）、黏附分子CD44，不表达内皮细胞标记CD31和白细胞标记CD45，符合MSC表型特征。三次细胞表型分析获得近似结果（图1）。

图1 脐带MSC表型特征Fig.1 The expression of CD31,CD44,CD45,CD73 in UC-MSCs

3.2 MSC治疗效果观察

2010年1月21日至2月11日，给予UC-MSC治疗1疗程，第一次输注1周后患者腹痛减轻，大便次数减为2次/日，脓血便明显减少；经首疗程治疗，患者精神、食欲恢复正常，腹痛及肠鸣音亢进消失，大便带有少许脓血，1～2次/日。维持2个月后，腹泻频率增加，腹痛再次出现，脓血便4次/日。4月22日开始应用肿瘤坏死因子单抗治疗 （隔周注射1次）。5月中旬大便次数减为2～3次/日，有少许脓血。6月大便为黄色成形软便，1～2次/日。7月开始出现脓血便，逐渐加重，最多10次/日。停用肿瘤坏死因子单抗，强的松龙增为60 mg/d，继续口服5-氨基水杨酸、硫唑嘌呤、整肠生、固肠止泻丸，治疗3月效果欠佳，脓血便8～10次/日，伴腹痛。2010年10月14日至11月4日，接受UC-MSC治疗1疗程，第一次治疗后腹泻次数减少为5次/日，腹痛较前明显减轻，为腹部隐痛，食欲改善。第二次治疗后腹泻次数进一步减少，2～3次/日，脓血便减少，腹痛较前减轻，强的松龙由60 mg/d逐渐减至50 mg/d。第三次治疗后腹泻消失。第四次治疗后，大便1～2次/日，黄色成形便，便常规潜血阴性。停止治疗1个月后，强的松龙减至30 mg/d，无明显不适主诉，大便正常，体重由该次治疗前的57 Kg增为60 Kg。治疗期间及治疗后无发热等任何不良反应记录。

3.3 病人外周血免疫细胞比例的改变

治疗前免疫细胞比例监测：CD3阳性细胞比例为83．1%，CD4为40．7%，CD8为38．2%，CD19（B淋巴细胞）为10．3%，CD56（NK细胞）为1．5%，Th/Ts= 1．07。治疗后检测：CD3阳性细胞比例为90．4%，CD4为 51．3%，CD8为 37．6%，CD19（B淋巴细胞）为8．7%，CD56（NK细胞）为0．45%，Th/Ts=1．39，较治疗前略有升高。

4 讨论

UC是一种局限于结肠黏膜及黏膜下层的炎症过程，以结肠黏膜弥漫性损害（炎症、糜烂、溃疡等）为特点，主要症状有腹泻、脓血便、腹痛和里急后重，病程漫长，常反复发作。本病可见于任何年龄，20～30岁最多见。其发生可能与现代生活方式、基因遗传、肠道菌群的免疫耐受缺失、免疫反应激活等因素有关。目前的治疗在于控制活动性炎症和调节免疫紊乱，包括抗炎药物、激素、免疫抑制剂、生物治疗等多种治疗手段，但无一具有长期疗效且副作用颇多。顽固性UC指诱导或维持缓解治疗失败，通常为皮质激素抵抗或依赖的病例。这些激素依赖或者抵抗的顽固性UC，病程迁延，局部和全身并发症增多，重度UC死亡率仍较高，严重危害患者的健康，寻找有效的治疗方法成为临床研究的难点和重点。

MSC是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，来源广泛，易于获取，在适宜环境中能够分化为内、中、外胚层或神经外胚层的细胞。一些研究显示MSC拥有归巢到损伤组织的能力，这与损伤部位炎性因子释放增多，而MSCs表达某些炎性因子受体有关[1－2]。MSC在损伤部位通过分化为损伤细胞类型，分泌适当的细胞因子和生长因子来参与组织的修复[3]。另外，MSC在体内及体外拥有独特的抑制免疫反应的作用[3]，通过细胞间的接触以及分泌可溶性抗炎因子，如肿瘤坏死因子拮抗剂等而发挥作用，可抑制T、B淋巴细胞的活化，降低树突状细胞抗原递呈作用及其功能，从而可能调节肠道的炎性反应[4]。动物实验表明，将异基因鼠骨髓MSCs静脉输注给UC大鼠，MSC多归巢于结肠病变部位，通过直接向肠系分化而使组织再生，并且在结肠部位炎性介质如TNF-α、IL-1β和环氧合酶-2（COX-2）明显减少，而生长因子b-FGF、HGF、VEGF明显升高，通过抗炎及促修复双重作用达到治疗目的，使大鼠便血减轻，体重增加[5]。临床上，MSC已用于治疗除UC外的另外两种炎性肠病，即克隆氏病及肠道移植物抗宿主病，均已进入Ⅱ期或Ⅲ期临床试验。国外有文献报道，将自体MSC局部注射入克隆氏病患者的9个瘘管中，8周后75%的瘘管愈合[6]。MSC治疗激素耐药的急性肠道移植物抗宿主病的Ⅱ期临床研究显示，55例患者接受HLA相合、半相合、完全不合供者的MSCs静脉输注，其中30例达到完全反应，9例有改善，无副作用发生，且有效率与HLA匹配无关[7]。截止目前，MSC对UC的治疗尚未见报道。

人脐带华尔通胶含有丰富的MSC，在体外可大量扩增，还可冻存，应用前复苏，短时间内即可收获足量的细胞用于临床治疗。Shetty等[8]比较骨髓、脐带、脐血获得的MSC，三种来源的MSC具有同样的MSC表面分子表达：CD73＋、CD105＋、SSEA4＋、CD29＋、CD44＋和HLA ABC＋，而不表达与移植排斥相关的HLA DR，在体外长期培养过程中能保持其多向分化潜能。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，抑制T细胞增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性[9]，表明其为一类免疫原低下细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。我们采用了脐带来源的MSC治疗。

本例患者诊断明确，发病时间3年，症状进行性加重而无特效治疗措施。经静脉注射MSC治疗，使患者腹痛、腹泻、脓血便消失。本文采用MSC输注治疗顽固性UC的方法安全有效。对于维持治疗还需要随访和扩大病例数，进行更为严重深入的研究。

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Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Infusion for the Treatment of Refractory Ulcerative Colitis

LIU Jing1,HAN

Dongmei1,XUE Mei1,ZHU Ling1,WANG Zhidong1,YAN Hongmin1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1.1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute ofRadiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author:WANG Hengxiang (E-mail: wanghengxiang123@yahoo.com.cn).

Objective To investigate the safety and effectiveness of umbilical cord mesenchymal stem cells infusion in the treatment of ulcerative colitis．Methods A patient with ulcerative colitis received two cycles of mesenchymal stem cell infusion at a dose of(1．5-1．8)×106cells/Kg once a week for 4 consecutive weeks．The phenotypic characteristics of peripheral blood immune cells were analyzed before and one week after the treatment by FCM．Results The patient's abdominal pain disappeared and diarrhea was completely controlled．The ratio of CD4＋/CD8＋cells was slightly elevated after cell infusions．Conclusion Mesenchymal stem cell infusion for the treatment of ulcerative colitis is safe and effective．The novel regimen described here might be a suitable choice for the treatment of refractory ulcerative colitis．

Mesenchymal stem cells;Ulcerative colitis;Infusion

Q813．1＋2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月8日；

2011年7月28日）

10．3969/j．issn．1673-0364．2011．05．001

首都发展基金重点项目（2007-2033），国家自然科学基金（30971068和30871018），军队临床高新技术重大项目（2009）。

100142 北京市 北京空军总医院血液科 （刘静，韩冬梅，薛梅，朱玲，王志东，闫洪敏，王恒湘）；100850 北京市 北京放射与辐射医学研究所（郭子宽）。

王恒湘（E-mail：wanghengxiang123@yahoo．com．cn）。