甘蔗遗传转化中膦丝菌素（PPT）筛选效率的比较

王继华，张木清，曹干

（1.福建农林大学生命科学学院，福州350002；2.广东省农业科学院作物研究所，广州510640）

甘蔗遗传转化中膦丝菌素（PPT）筛选效率的比较

王继华1，2，张木清1，曹干2

（1.福建农林大学生命科学学院，福州350002；2.广东省农业科学院作物研究所，广州510640）

从PCR检测水平评价了PPT在再生过程，再生植株喷施和体外浸泡中筛选方法的效率，结果表明PPT浸泡方式效率最高，能够准确鉴定出转Bar基因甘蔗。

甘蔗；筛选效率；转化

Bar基因能够编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricin acetyltransferase，PAT）使草丁膦的有效成分膦丝菌素（phosphinothricin，PPT）的自由氨基乙酰化，不能抑制GS的活性[1]。草丁膦是一种非选择性的广谱性除草剂，能够抑制谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性，导致植物死亡，目前已在50多个国家登记注册[2]。植物导入Bar基因后，能够对草丁膦产生抗性。与其它筛选标记基因如荧光蛋白基因、潮霉素抗性基因和卡拉霉素抗性基因相比，Bar基因具有可靠的生态环境安全性，同时具有除草剂抗性功能。Bar基因成为植物转基因研究中的良好筛选和标记基因，因此在植物转基因研究中被广泛采用。Bar基因已经通过基因枪、农杆菌和花粉管通道等转化方式导入到不同植物中。

甘蔗生长前期生长缓慢，容易受到杂草抑制，人工除草效率低，投入高。种植具有除草剂抗性的转基因甘蔗结合直接喷施除草剂能够实现机械化，减少种植成本。抗除草剂转基因甘蔗具有良好的应用前景，开发一套适合抗除草剂转基因的快速鉴定方法能够提高育种效率。目前，Bar基因已经转入甘蔗，一般是通过在再生阶段对培养基中添加一定浓度的PPT，作为筛选物质来抑制非转化子，只有转入Bar基因的细胞或者组织具有抗性不会产生伤害，得到抗性植株后，通过对再生植株的喷施进行鉴定[3-5]。但是没有通过PPT离体浸泡的方法进行鉴定的报道。同时对于PPT在不同的阶段筛选效率也没有相关研究。本研究通过对3种方法筛选到的甘蔗再生群体进行PCR鉴定，比较筛选效率，以期得到有效的筛选方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

基因枪转化含有Bar基因的再生植株群体，甘蔗品种为新台糖20号。

1.2 试验方法

1.2.1 转基因再生植株的获得与抗性筛选取用叶为外植体诱导出的胚性愈伤组织，采用PDS-1000/He型基因枪将含有Bar基因的金粉轰击愈伤组织。经过25℃黑暗条件恢复培养3d后，在继代培养基和分化培养基中附加1mg/L PPT进行抗性筛选。当小苗约3～4 cm高时转入含有2 mg/L PPT生根培养基。当诱导出的根达2～3 cm长时，移栽到育苗盘中。

1.2.2 PPT喷施筛选采用不同浓度PPT溶液（5、10、20、30 mg/L）喷施未转基因甘蔗再生植株，20 mg/L的PPT能够导致植株叶片产生除草剂伤害斑。以浓度为20 mg/L的PPT溶液喷施移栽成活的转化甘蔗植株。

1.2.3 PPT浸泡筛选剪取未转基因甘蔗再生植株3～5cm长的叶片，浸入装有不同浓度PPT溶液（10、20、30、40 mg/L）的试管中，30 mg/L PPT溶液能够致使植株叶片黄化。剪去待检测的植株叶片，浸入含有30 mg/L的PPT溶液中进行筛选，以未转基因作为对照，到对照完全变黄时，进行统计观察。

1.2.4 植株PCR分析按照王继华等（2007）方法进行[6]。取植株叶片，采用微量法提取总DNA进行PCR扩增。PCR扩增引物是ZG3：5'ACCATCGTCAACCACTACAT-3'；ZG4：5'AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反应体系：模板DNA 50～100 ng，10×Buffer 1.5μL，10 mmol/L dNTP 0.35μL，10 mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25 mmol/L MgCl21.0μL，Taq酶（5 U/μL）0.2μL，加ddH2O至15μL。反应条件：95℃预变性3 min;95℃30 s，60℃40 s，72℃40 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果分析

2.1 转化阶段PPT对材料的筛选

1mg/L PPT能够完全抑制新台糖20号愈伤组织生长，对转化后的材料接种到含有该浓度PPT的培养基上进行抗性筛选，每4周继代1次，总共筛选3次。在继代阶段大部分愈伤组织呈水渍状，失去胚性。在分化培养基上大部分愈伤组织逐步褐化，最终死亡，少数能够分化出小苗。待抗性小苗长至3～4 cm高时，进行生根诱导，大部分植株能够长出正常根系。当诱导出的根达2～3 cm长时，移栽到育苗盘中。

图1 PPT对愈伤组织继代的筛选

图2 PPT对愈伤组织分化的筛选

图4 PPT喷施筛选

图5 PPT浸泡筛选

2.2 对PPT喷施筛选阳性植株

选取200株移栽成活的转化植株，采用20 mg/L的PPT进行喷施，2周后进行统计，其中有67株没有出现除草剂伤害斑点。

2.3 PPT溶液浸泡筛选

取200株植株叶片浸入到30 mg/L PPT溶液，以转基因甘蔗作为对照，到对照完全变黄时，进行统计观察。共有21株表现出绿色，并且21株在喷施中均无伤害斑点，选取叶片保持绿色的株系进行PCR检测。

2.4 PCR检测

分别提取200株移栽成活的再生植株DNA，进行PCR检测。其中能够扩出目的片段的株数为21，筛选效率为10.5%。这21株在PPT喷施和PPT浸泡处理中均为阳性，结果表明PPT浸泡的筛选效率要高于喷施，能够有效快速地对转Bar基因甘蔗进行鉴定。

图6 PCR电泳检测图

3 结论

利用Bar基因作为转基因研究中的筛选标记基因通常结合筛选物质除草剂的特性加以利用[7]。通过直接检测植株的除草剂抗性来筛选转基因阳性植株能够大大降低后期分子鉴定的工作量。目前，采用PPT喷施再生株能够减少61.5%的假阳性植株。通过选取转化植株的叶片进行离体浸泡的方法进行鉴定，能够减少89.5%的工作量。同时离体浸泡的方法能够直观地判断转基因植株的表达，在转基因抗除草育种中能够有广泛的用途。

[1]Rathore K S，Chowdhury V K.Use of bar as a selectable marker gene and for the production of herbicide resistant rice plants from protoplasts[J].Plant Mol Boil，1993，21（5）:871-884.

[2]William H A.Herbicide handbook//7th edition[M].Illinois:Weed Science Society of America，1994，147-149.

[3]M.Manickavasagam，A.Ganapathi，V.R.Anbazhagan，et al.Agrobacterium mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane（Saccharum species hybrids）using axillary buds[J].Plant Cell Reports，2004，23（3）：134-143.

[4]Gil A.E.，Roberto I.V.，Dmitri L.P.，et al.Herbicide-resistant sugarcane（Saccharum officinarum L.）plants by Agrobacterium mediated transformation[J].Planta，1998，206（1）：20-27.

[5]M.C.F.，A.Tulmann N，E.C.Ulian.Transformation and expression of a gene for herbicide resistance in a Brazilian sugarcane[J]. Plant Cell Reports，2000，19（12）：1188-1194.

[6]王继华，李余良，胡建广，等.一种转基因甘蔗基因组DNA的快速提取方法[J].甘蔗糖业，2007(6)：6-7，17.

[7]段发平，梁承邺，黎垣庆.Bar基因和转Bar基因作物的研究进展[J].广西植物，2001，21（2）：166-172.

Screening Efficiency of Phosphinothricin（PPT）in Sugarcane Transformation

WANG Ji-hua1，2，ZHANG Mu-qing1，CAO Gan2
（1.College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 50002，China；2.Crop Research Institute，Guangdong Academy of Agriculture Sciences，Guangzhou 510640，China）

Bar gene as a common marker is widely used in transgenic sugarcane.The research was conducted to evaluate the screening efficiency of PPT used at the stage of regeneration and the regeneration plants by spraying or in vitro soaking.The results showed that the highest screening efficiency was found in the regenerated plants by soaking in vitro which could accurately identify the transgenic sugarcane mediated with Bar gene.

sugarcane；screening efficiency；transformation

S566.101；Q78

A

1007-2624（2011）03-0012-03

2011-03-15

国家“863”项目：斑茅FKBP12基因在甘蔗抗旱上的作用网络研究（2008AA10Z114）；广东省自然科学基金：转Bt基因甘蔗的外源基因表达分析及其与抗虫性关系（10151064001000032）；广东省科技攻关项目：抗旱转基因甘蔗选育（2010B020301001）。

王继华（1979-），男，在职博士研究生，研究方向：甘蔗转基因育种。

张木清（1966-），男，博士，研究员，研究方向：甘蔗育种与分子生物学，E-mailzhmq@163.com