多途径干预HH cy致兔动脉粥样硬化的对比研究

康爱英 王国庆

南阳医学高等专科学校 南阳 473058

近年研究发现,高同型半胱氨酸血症(HHcy)是诱发动脉粥样硬化(AS)的独立危险因素[1],因此,开展HHcy致AS的防治研究是心、脑血管病领域的热点问题。目前,对HHcy的防治多集中在补充叶酸和维生素B6、B12方面,而牛磺酸(Taurine,Tau)和中药丹参(Salvia M iltiorrhiza)对HH-cy的影响国内外少有报道。本文采用高蛋氨酸饮食的方法建立HHcy兔动物模型,观察HHcy致AS形成机制;比较分析牛磺酸、维生素及丹参对HHcy所致AS的干预效果,为HHcy的防治,延缓或阻止AS的形成,降低心、脑血管病的发生风险开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 药品、仪器 L-蛋氨酸购自张家港市华昌药业有限公司,牛磺酸上海伯奥生物科技公司提供。同型半胱氨酸(H cy)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)试剂盒购自北京九强生物技术和南京建成有限公司。美国GELg-9彩色多普勒超声诊断仪,TBA-120FR生化分析仪,日本JVCTK-C921EC显微镜摄像机、OLYM PUSCX31显微镜,德国m ICROMGMBH Hm 200切片机、CSˉ摊片机。

1.2 动物分组 筛选健康雄性家兔50只(武汉嘉禾实验动物公司提供),月龄3～5个月,体质量1.5～2.0 kg,标准饲料适应性喂养2周,随机分为对照组(NC)、蛋氨酸组(Met)、牛磺酸组(Tau)、维生素组(V it)、丹参组(SM)5组,每组10只。

1.3 H hcy动物模型的建立 (1)蛋氨酸饲料的制备:标准饲料按家兔标饲配方制成,在标饲中添加2%的蛋氨酸即为蛋氨酸饲料。(2)丹参口服液由南阳医专中医药教研室用丹参经煎制、过滤、浓缩为1g/m L(以生药计),经高压灭菌备用。(3)动物饲养:NC组喂标准饲料;Met组喂蛋氨酸饲料;Tau组蛋氨酸饲料+牛磺酸0.3g/(kg◦d)只灌胃;Vit组蛋氨酸饲料+叶酸1.5 mg/(kg◦d)、VB120.25 mg/(kg◦d)、VB620 mg/(kg◦d)灌胃;SM组蛋氨酸饲料+丹参口服液3.3 g/(kg◦d)灌服。动物饲料按100g/(d◦只)计算,分笼饲养,隔周称重,连续喂养8周。(4)Hhcy模型判定:0周时测定各组兔血浆H cy含量,确定正常参考值;4周时再次检测,以血浆Hcy水平超过正常参考值上限,判定HHcy病理模型是否成功。

1.4 生化指标检测 分别于第0周、4周、8周末时,自兔耳缘静脉采血2 m L,用酶法或比色等法测定Hcy、TC、TG、NO、M DA、SOD、ET、TXB2含量,试剂盒由北京九强和南京建成公司提供。

1.5 血管超声检查 用彩色多普勒超声诊断仪,血管探头频率为4～10 MHz,分别于第4周、8周末对各组家兔进行腹主动脉血管超声检查,测量动脉内-中膜厚度(IM T)及血流峰值(Vp)。同时观察血管内膜光滑程度、有无粥样斑块形成。

1.6 病理学检查 实验8周末,处死动物,取腹主动脉血管,10%福尔马林固定、取材、石蜡切片、H-E染色,光镜观察。

2 结果

2.1 各组家兔血浆H cy含量变化 0周时各组家兔血浆H cy含量16.67～22.44μmol/L(即正常参考值),超过上限确定为HHcy。实验期间各组家兔一般情况良好,Met组有2只、Tau组1只死亡。各组兔血浆H cy含量变化见表1。

表1 各组家兔血浆H cy含量比较 (±s,μmol/L)

表1 各组家兔血浆H cy含量比较 (±s,μmol/L)

注:与NC组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与Met组比较,★P＜0.01;与Tau组比较,◆P＜0.05,◆◆P＜0.01

组别0周(只)4周(只)8周(只)NC组18.15±1.71(10)18.12±1.33(10)19.09±1.20(10)Met组19.34±1.65(10)62.92±2.26(9)**65.23±1.12(8)**Tau组18.47±1.02(10)57.03±2.19(10)**58.27±2.25(9)**SM组18.13±2.01(10)53.44±2.33(10)**56.37±1.29(10)**Vit组19.23±2.47(10)32.53±1.28(10)*★◆22.35±2.30(10)★◆◆

2.2 各组家兔血清TC、TG、MDA、SOD含量变化 各组血清TC、TG、MDA、SOD含量变化见表2。

表2 各组家兔血清TG、TC、MDA、SOD含量比较 (¯±s)

表2 各组家兔血清TG、TC、MDA、SOD含量比较 (¯±s)

注:与NC组同期比较,＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;与Met组同期比较,﹟P＜0.05,﹟﹟P＜0.01

组 别时间n TG(mmol/L)TC(mmol/L)M DA(μmol/L)SOD(U/m L)NC组4周10 1.05±0.13 1.56±0.11 21.83±7.32 368.32±25.14 8周10 1.06±0.09 1.57±0.12 22.32±6.02 370.28±23.46 Met组4周9 1.21±0.03*1.74±0.08*40.06±9.03**311.58±24.38**8周8 1.41±0.09*1.93±0.14*45.27±8.16**285.35±26.30**Tau组4周10 1.13±0.10 1.56±0.16#28.27±5.11*#406.69±22.06##8周9 1.12±0.11 1.61±0.15﹟24.36±6.72##423.28±24.21##SM组4周10 1.07±0.11#1.52±0.16#26.20±0.18#439.62±27.63##8周10 1.02±0.07#1.66±0.13#23.12±0.17##473.69±28.09##V it组4周10 1.08±0.12#1.59±0.10 25.24±5.58#416.16±18.97##8周10 1.09±0.12#1.65±0.18#22.48±7.44##420.48±21.56##

2.3 各组家兔血清NO、ET、TXB2含量变化 实验8周时,各组血清NO、ET、TXB2含量变化见表3。

表3 实验8周各组家兔NO、ET、TXB2含量比较 (±s)

表3 实验8周各组家兔NO、ET、TXB2含量比较 (±s)

注:与NC组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与Met组比较,#P＜0.05,##P＜0.01

组 别n NO(μmo l/L)ET(ng/L)TXB2(ng/L)NC组10 99.33±19.41 172.25±30.32 134.50±29.17 Met组8 57.96±13.80*309.91±31.83**345.33±35.27**Tau组9 150.29±20.26**##180.65±28.52##162.37±32.90##SM组10 132.12±14.22*##192.28±17.36##154.48±21.43##V it组10 159.37±30.26**##178.92±26.90##145.68±24.36##

2.4 各组家兔腹主动脉超声检查结果比较 实验4周时,NC组血管内膜线细、光滑、连续性好;M et组血管内膜欠光滑,边缘不整齐,有中等偏低回声团块(即软斑形成);Tau、SM和V it干预组无明显改变。8周末,M et组血管IM T明显增厚(P＜0.01),有偏强回声团,斑块边界不清,Vp显著增快(P＜0.01)。Tau、SM和Vit干预组与Met比较IM T显著减小,Vp显著减慢(P＜0.05),均未见斑块形成,3组间比较差异无显著性。

2.5 各组家兔腹主动脉血管病理变化 大体观察:沿腹主动脉管壁剪开,NC组无斑块形成,M et组可见不规则隆起斑块。光镜下观察:NC组血管内膜薄而光滑,连续性好,中膜平滑肌细胞排列整齐,管壁厚薄均匀。M et组:血管内膜明显增厚,斑块突出于内膜面,内膜下大量排列不规则的平滑肌细胞,中层结构紊乱,斑块深部的泡沫细胞有变性坏死、崩解,形成细颗粒状粥糜样物质,中膜变浅,浅层肌纤维分离断裂。Taut、SM和Vit干预组血管内膜光滑,8周时内膜有轻度增厚,内膜下有少量含脂质的泡沫细胞,中膜平滑肌细胞排列整齐,管壁厚薄均匀。

3 讨论

AS、脑卒中、冠心病是现代医学中最大的医学难题,由此而引起的致死率在中国乃至全世界都直线上升。近年的研究证实HH cy是AS新的、独立的危险因子,引起HHcy的原因有营养因素或遗传因素。

3.1 HHcy家兔病理模型制备成功 本研究给家兔喂饲高蛋氨酸饲料,实验第0周、4周、8周时测定血清Hcy水平,Met组血清H cy含量均显著高于同期NC组,表明兔HHcy模型制备成功。腹主动脉超声及组织学检查显示,血管内膜明显增厚,中层结构紊乱,有细颗粒状粥糜样物质及斑块形成,均为动脉硬化改变,故认为,HHcy可引起动脉血管发生病理改变,是致AS的独立危险因素。

3.2 HHcy致动脉粥样硬化的机制 HHcy致动脉粥样硬化的机制目前尚未完全阐明,可能与血管内皮损伤和功能失调、刺激血管平滑肌增值、促进血小板聚集、破坏体内凝血与纤溶之间的平衡等因素有关[2]。血管内皮细胞作为血管壁与血流之间的屏障,其损伤和功能的减退是动脉粥样硬化的重要始动因素。H cy升高可通过氧化应激及活性氧基团导致内皮功能紊乱,引起血管内皮损伤。实验中发现,Met组家兔血清MDA、TG、TC、ET和TXB2含量显著高于NC组,而NO含量、SOD活力则明显降低。结果提示,HHcy家兔体内氧化应激增强,Hcy是多功能损伤因子[3],其分子中含自由的巯基,在自身氧化生成同型胱氨酸的同时,生成多种强氧化产物(如H2 O2、氧自由基等),造成血管内皮细胞损伤和强烈的毒性作用,并启动细胞膜脂质过氧化反应,使MDA产生增多,消耗了SOD等自由基清除系统;而且H cy的升高可抑制SOD的表达和分泌,导致内皮细胞抗氧化机制受损[4],并加强了超氧自由基介导的NO灭活作用,引起内皮细胞功能失调,破坏细胞的完整性,使血管内皮细胞骨架结构发生变化;Hcy还能促进脂蛋白的沉积,并被巨噬细胞吞噬形成泡沫细胞,损伤血管内皮细胞,引起动脉粥样硬化斑块形成。

本实验M et组家兔血清ET、TXB2显著增多,NO含量明显减少,与文献报道相符。家兔腹主动脉内膜发生明显病理改变,充分表明HH cy家兔体内正常的血管内环境稳定被破坏,是因为Hcy升高损伤了血管内皮,促进血管平滑肌细胞增殖、迁移,使多种血管活性物质的生成和分泌失衡[5],即收缩血管,促进血小板聚集和血栓形成,刺激平滑肌细胞增殖的ET、TXB2增多,而血管松弛因子NO含量减少,从而导致内皮依赖性血管舒张功能失调,促进AS的发生和发展。

3.3 FA、B6、B12有效地降低血浆H cy水平 FA在体内还原为四氢叶酸,参与甲基的转移;维生素B12为蛋氨酸合成酶的辅酶,催化N5-甲基四氢叶酸脱去甲基再生成四氢叶酸,而Hcy获得甲基生成蛋氨酸。维生素B6是胱硫醚合成酶的辅酶,催化Hcy与丝氨酸结合成胱硫醚,进一步分解代谢。本实验V it干预组血清Hcy、MDA、ET、TXB2含量显著低于Met组,NO含量、SOD活力明显升高;血管超声及组织学观察,内膜较光滑,内膜及中膜平滑肌细胞未见增生,与NC组比较无显著差异。提示FA、VB6、VB12是同型半胱氨酸代谢主要的辅助因子,加速了H cy再甲基化或硫化进程,有效降低H cy水平,从而减轻血管内皮的损伤、血管平滑肌的增值,阻止或延缓了AS发生。

3.4 牛磺酸的抗动脉硬化作用 牛磺酸是一种含磺酸基的自由氨基酸,不参与蛋白质的合成,长期被看作是含硫氨基酸代谢的无功能产物。近年研究发现[6],牛磺酸具有维持渗透压、稳定细胞膜、调节细胞钙稳定、清除自由基、抑制脂质过氧化等生物学效应。HHcy还可导致大鼠血管内皮细胞结构受损,弹力纤维层排列紊乱、血浆ET含量增加,外源性增补牛磺酸完全抑制了H cy诱导的上述血管病变。

本研究Tau组家兔血清MDA、ET、TXB2含量显著低于M et组,NO含量、SOD活力明显升高,而H cy含量显著高于NC组但与Met组比较无显著差异;血管超声及组织学观察,血管内膜光滑,IM T比Met组显著变薄,Vp显著减慢,与NC组比较无显著差异。结果显示,牛磺酸不仅抑制Hcy诱导的呼吸链电子漏出及氧自由基生成[7]和脂质过氧化,降低MDA含量,增加SOD活力,拮抗Hcy引起的氧化应激损伤;还可上调NO含量,降低ET、TXB2水平,从而起到舒张血管,保护内皮细胞作用。牛磺酸作为H cy的生物拮抗剂,可不通过降低血浆H cy水平而直接拮抗H cy引起的血管病变和氧化应激损伤,从而发挥抗AS形成的作用。

3.5 丹参对HH cy家兔动脉粥样硬化形成的干预作用 本研究中SM组血浆Hcy含量高于NC组,但与M et组同期比较TG、TC、MDA、ET、TXB2含量显著降低,NO、SOD活显著升高;血管超声及组织学观察无斑块形成,故认为丹参不但有抗高脂血症引起的AS,而对HH cy所致家兔动脉粥样硬化的形成也有干预作用。其机制可能是丹参的有效成分丹参酮具有天然抗氧化作用[8],通过消除脂类自由基而阻断脂质过氧化的链式反应;降低缩血管成分ET、TXB2水平,提升血管松弛因子NO含量,起到舒张血管,保护内皮细胞;调节HHcy家兔体内凝血与纤溶之间的平衡等因素,从而发挥其延缓或阻止HHcy兔动脉粥样硬化形成的作用。

综上所述,高蛋氨酸饮食可诱发家兔HHcy,Hcy升高可通过损伤血管内皮、促进血管平滑肌增殖等机制,导致AS的发生。外源性补充FA、B6、B12加速Hcy代谢,降低血浆Hcy水平,减轻血管内皮的损伤;牛磺酸和丹参虽不能降低血浆H cy含量,但通过抑制Hcy诱导的氧化应激和细胞增值,调节血管舒缩及凝血与纤溶之间的平衡等因素,发挥其抗AS形成的作用。可见丹参、牛磺酸、维生素通过不同途径干预HH cy家兔AS形成,其干预效果维生素和丹参优于牛磺酸。

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