β-七叶皂甙钠对脑缺血-再灌注损伤大鼠自由基的影响

刘 梅 李小刚 谭 华

1)成都市第六人民医院神经内科 成都 610000 2)泸州医学院附属医院神经内科 泸州 646000

脑缺血-再灌注损伤是多种致病因素共同作用互相促进的结果。缺血性脑血管病在治疗上强调早期综合治疗。β-七叶皂甙钠已被应用于脑水肿及脑神经功能失调,具有消水肿及清除自由基,改善微循环,抑制细胞凋亡等作用[1],从而减轻缺血-再灌注损伤,达到保护神经细胞的作用。我们旨在研究β-七叶皂甙钠在自由基方面对缺血再灌注损伤的影响,为临床治疗提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠45只,体质量200～300 g;随机分为3组:假手术组(n=15)、缺血-再灌注组(n=15)和β-七叶皂甙钠治疗组(n=15)。治疗组再灌注即刻腹腔内注射β-七叶皂甙钠注射液(10 mg/kg),缺血-再灌注组将β-七叶皂甙钠换成等毫升生理盐水。

1.2 方法

1.2.1 栓线的处理:为保证能完全堵住MCA的起点,并避免伤及血管内皮和刺破血管,应对线栓头端进行“钝化”处理,将尼龙线放入0.1%多聚赖氨酸中浸泡10 h,然后取出,在60℃烘箱中干燥1 h备用,使线栓头变得略钝圆。整个过程并不改变尼龙线的直径。

1.2.2 大鼠缺血-再灌注模型的制作:采用Zea Longa[2]的大脑中动脉线栓法并加以改进,将动物仰卧固定于手术台上,分离右侧颈总动脉和颈内动脉及颈外动脉,结扎颈外动脉和颈总动脉,在颈内动脉下方穿一提拉线以暂时阻断血流,在颈总动脉距分叉处将尼龙线插入颈总动脉,进入颈内动脉,结扎颈内动脉下方栓线并固定。缺血2 h后轻轻拔出栓线,形成再灌注。根据Bederson等[3]评定方法分为0～3级。0级:向地面伸展两前肢,未见行为异常;1级:脑损伤对侧前肢持续屈曲;2级:脑损伤对侧前肢屈曲,脑损伤对侧肩内收但无扭转,侧推抵抗力弱;3级:脑损伤对侧前肢屈曲,脑损伤对侧肩内收且有扭转,侧推抵抗力弱。神经症状达1～3级之一者判断为模型成功。入选动物断头取脑时发现有蛛网膜下腔出血则弃之不用。

1.3 观测指标

1.3.1 神经功能缺失评分:采用Zea Longa[2]的评分方法。大鼠局灶性脑缺血-再灌注后经功能缺损评分:0分,无神经系统功能缺失,活动正常;1分,不能完全伸展对侧前爪;2分,爬行时出现向瘫痪侧转圈;3分,爬行时向瘫痪侧倾倒;4分,不能自行行走,有意识障碍。得分越高表明神经功能缺损程度越重,相反损害较轻。

1.3.2 脑组织光镜观察:每组随机选取5只动物,取缺血区及其周边脑组织,固定于4%甲醛中,4℃冰箱保存,常规石蜡切片,HE染色,光镜观察病理形态改变。

1.3.3 术后脑组织TTC染色:将假手术组和缺血-再灌注组的大鼠迅速断头取脑,去除低位脑干和小脑,将脑组织置入4%TTC溶液中,在37℃条件下孵育30 min,每4～5 min翻动一次。

1.3.4 脑缺血区SOD和MDA含量的测定:于相应各时间点(缺血2 h后再灌注6 h、12 h、24 h)断头截取缺血侧皮层脑组织,称重后制成10%的脑组织匀浆,按照试剂盒采用放射免疫法测定SOD和MDA含量。

1.4 统计学处理 应用SPSS 11.0统计软件进行分析,所有数据采用±s表示,组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 神经功能损害评分 假手术组动物无明显神经功能缺失,治疗组和缺血-再灌注组动物均有不同程度的神经功能缺失,且治疗组神经功能缺失有所改善,呈减轻趋势,P＜0.05。见表1。

2.2 脑缺血-再灌注模型TTC染色 TTC目前被认为是脑组织缺血性损伤的标记物[4]。T TC能与正常线粒体氧化酶系统发生反应而降解成深红色的脂溶性化合物。受损线粒体缺乏降解T TC的酶而呈现白色使得受损组织与正常组织极易区分开来。TTC染色已被用于标记脑梗死面积[4]。由于正常脑组织的酶使TTC分解变红色,所以TTC染色时,正常脑组织呈红色,梗死灶呈白色[4]。从图1我们可以看到,假手术组脑组织呈红色,缺血-再灌注组大鼠皮质梗死区呈苍白色,未缺血区呈红色,与大脑中动脉支配的脑区一致,间接说明模型造模成功(见图1～2)。

表1 术后各组神经功能损害评分 (±s)

表1 术后各组神经功能损害评分 (±s)

组 别n各时间点术后6 h 术后12 h 术后24 h假手术组150*0*0*缺血-再灌注组152.8±0.842.8±0.452.6±0.55治疗组151.8±0.84*1.6±0.55*1.2±0.45*

2.3 病理结构改变(HE染色) 假手术组脑组织的结构较完整,缺血-再灌注组脑组织可见缺血坏死区,细胞水肿明显,神经元崩解为大量的无定形组织,呈嗜伊红染色,也可见胶质细胞增生;治疗组也可见神经元坏死,但残留的神经元较多,细胞水肿程度相对较轻。见图3～5。

2.4 术后各组脑组织SOD含量的变化 见表2。缺血-再灌注组和治组SOD含量显著低于假手术组相(P＜0.05),治疗组SOD含量明显高于缺血-再灌注组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 术后各组脑组织M DA含量的变化 见表3。缺血-再灌注组和治疗组MDA含量显著高于假手术组(P＜0.05);治疗组MDA含量与缺血-再灌注组比较明显降低(P＜0.05)。

表2 术后各组脑组织SOD含量的测定(±s,U/mL)

表2 术后各组脑组织SOD含量的测定(±s,U/mL)

组 别n各时间点(n=5)术后6 h 术后12 h 术后24 h假手术组15 29.21±1.24*#29.45±0.64*#30.08±0.63*#缺血-再灌注组15 15.82±0.5818.05±1.0020.62±0.80治疗组15 18.75±0.75*20.88±0.48*23.21±0.72*

表3 术后各组脑组织MDA含量的测定(±s,nmol/mL)

表3 术后各组脑组织MDA含量的测定(±s,nmol/mL)

组 别n各时间点(n=5)术后6 h 术后12 h 术后24 h假手术组15 6.18±0.22*#6.18±0.23*#6.19±0.23*#缺血-再灌注组15 13.72±0.512.32±1.0110.30±0.88治疗组15 11.71±0.74*9.77±0.82*8.02±0.44*

3 讨论

目前临床上对于缺血性脑梗死的治疗,目的主要是保护缺血半暗带,阻止其发展成不可逆的缺血性损伤,超早期溶栓治疗为缺血脑组织的再灌注提供了可能性,但再灌注的同时引起的氧自由基大量释放。自由基是一类具有高度化学反应活性的毒性很强的代谢产物。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物,其含量的变化间接地反应了脑组织中氧自由基含量的变化,因此通过测定MDA含量可以估价脑组织中氧自由基含量和组织损伤程度[5]。SOD是一种带负电荷的蛋白质,SOD进入脑细胞浆、细胞外间隙,通过歧化的方式发挥清除超氧阴离子自由基的作用[6]。SOD在组织中的含量常作为清除氧自由基能力的主要指标。

本实验结果显示,假术组中SOD和MDA含量在三个不同时间点无明显变化,缺血-再灌注组脑组织SOD和MDA含量与假手术组各时间点比较,SOD含量明显降低,MDA含量显著升高。在缺血-再灌注组中,SOD在缺血-再灌注后6 h活性最低,随着时间延长活性逐渐增强;MDA在缺血-再灌注后6 h时含量最高,12 h时逐渐降低,在24 h时含量最低,三个时间点比较差异具有统计学意义,MDA降低和SOD升高呈负相关,这说明氧自由基参与了脑缺血-再灌注损伤过程;随着脑组织损伤程度的加重,氧自由基释放大量增加,代谢产物逐渐增加,故MDA含量增加,但机体随之启动清除自由基系统,故SOD含量虽然在6 h时活性相对较低,12 h后开始逐渐增加,24 h时达高峰。不过,由于我们没有对脑缺血-再灌注后30 min、1 h或48 h甚至更多的时间点进行观察,故不能判断SOD和MDA的动态变化过程,如机体还没完全调动抗自由基系统,SOD是否在6 h时活性最低、在什么时候出现高峰、有没有2次高峰等情况。自由基可能通过以下机制加重缺血性脑损伤:(1)自由基的代谢产物可攻击细胞的脂类、蛋白质及核酸等成分,其中活性氧自由基对生物膜(膜上多价不饱和脂肪酸)的脂质过氧化损伤最为广泛和严重,可致细胞结构的改变,完整性破坏;线粒体膜损伤可致能量代谢紊乱,呼吸链受损,氧化磷酸化脱偶联;溶酶体膜受损可致溶酶体酶释放。(2)自由基攻击蛋白质可致蛋白质变性、降解、功能丧失。(3)自由基攻击DNA分子,可引起DNA损伤,导致基因突变,使正常细胞转化为增殖分化异常的癌细胞,参与诱导神经元凋亡,有实验证实消除氧自由基可以减少培养的皮质神经元凋亡[7]。(4)自由基还可攻击血管内皮细胞膜,加重血管源性脑水肿[8]。从本实验中我们可以看出,缺血-再灌注组SOD含量在三个不同时间点较假手术组低,而M DA含量反而高于假手术组,表明自由基参与了缺血性脑损伤。

本实验结果表明,β-七叶皂甙钠治疗组在不同时间点脑组织SOD含量增加,MDA含量下降,与缺血-再灌注组各时间点比较差异具有统计学意义;从病理形态改变上我们也可以看出,β-七叶皂甙钠治疗组的神经细胞坏死程度减轻,主要表现为轻度的细胞水肿,损伤程度明显轻于缺血-再灌注组。神经功能损害评分也显示,β-七叶皂甙钠治疗组明显优于缺血-再灌组。这说明β-七叶皂甙钠能抑制氧自由基的产生,使MDA含量下降,同时使脑组织SOD活性升高。Guillaume等[9]研究发现,欧马栗提取物(horse chestnut extract,HCE,其中含70%的七叶皂甙)具有抗自由基作用,体外实验发现,HCE呈剂量依赖性抑制酶性和非酶性引发的脂质过氧化;体内试验证实,HCE能减轻氧自由基对细胞及其周围组织的毒性作用。张奕等[10]通过对家兔脑皮质组织SOD活性和MDA浓度的测定,发现5 mg/kg的β-七叶皂甙钠能够提高脑组织SOD的活性、降低MDA含量。β-七叶皂甙钠的神经保护作用机制之一可能是通过抗自由基途径,以减轻自由基对脑细胞的不同结构的损伤,减轻脑水肿、细胞凋亡。

[1] 崔丽,郑惠民,陶沂,等.七叶皂甙钠对大鼠局灶性脑缺血损伤炎症反应的作用[J].第二军医大学学报,2003,24(3):330-332.

[2] Longa EZ,Weinstein PR,Carson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without crainietomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[3] Bederson JB,Pitts LH,T suji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986;17(3):472-476.

[4] 欧润妹,巫志峰.大鼠脑缺血模型的制备方法与评价指标总结[J].中国现代实用医学杂志,2005,4(12):33-35.

[5] 徐忠信,杨宏,钱桂利,等.急性脑缺血再灌注损伤钙离子与氧自由基作用实验研究[J].中风与神经疾病杂志,1995,12(6):331-333.

[6] 夏绪刚,黄兆民,欧阳珊.氯奎、SOD防治脑缺血-再灌注损伤的实验研究[J].中风与神经疾病杂志,1997,14(2):84-86.

[7] Patel M.Inhibition of neuronal apoptosis by a metalloporphyrin superoxide dismutase mimic[J].Neurochem,1998,71(3):1 068-1 074.

[8] 张秀洲,刘雪平,李文华,等.大鼠脑缺血再灌注后细胞因子和自由基的动态变化[J].中国老年学杂志,2005,25(8):962-963.[9] Guillaume M,Padioleau F.Veintonic effect,vascular protection,anti-inflammatory and free radical scavenging properties of horse chestnut ex tract[J].Arzneimittelforschung,1994,44(1):25-35.

[10] 张奕,付强,崔乃杰.β-七叶皂甙钠对家兔脑缺血-再灌注损害的保护作用[J].急诊医学,1998,7(1):23-26.