我国鱼类遗传多样性的研究技术及进展

向文殿，林 佳

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北，武汉，430023)

我国鱼类遗传多样性的研究技术及进展

向文殿，林 佳

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北，武汉，430023)

随着研究方法和实验技术的不断发展，我国鱼类遗传多样性的研究工作从形态学、细胞学、生化水平逐渐发展到了DNA水平，在此从几个方面介绍了鱼类遗传标记的发展和应用现状。

鱼类;遗传多样性;研究技术

鱼类是自然界中人类主要的动物食品之一，具有丰富的营养价值。我国现有鱼类3862种，占世界鱼类总数的20.3%，占我国脊椎动物总数的60.8%。分布在我国的淡水(包括沿海河口)鱼类共有1050种，分属于18目52科294属;海洋鱼类迄今记录有3048种，隶属288个科［1］。但由于我国追求经济高速发展，造成了鱼类资源急剧下降［2］。一个鱼类群体的遗传多样性越丰富，就越能适应新的环境。反之，遗传多样性越小，会因为环境恶化、过度捕捞等影响，导致种群数量减少、遗传衰退等现象，从而使遗传多样性贫乏，最终导致该物种灭绝概率的增加，且鱼类遗传多样性的丧失是人类赖以生存资源的永久性丧失，因而保护其种质资源非常重要。遗传多样性研究作为鱼类资源保护的重要手段，起着关键作用。本文就遗传多样性研究的各种标记进行归纳总结，旨在为鱼类遗传多样性研究提供理论参考。

鱼类中蛋白含量高，脂肪含量低是可溶的“不饱和脂肪酸”，肉质鲜嫩，深受人们喜爱。鱼类肉质中含丰富的蛋白质、脂肪酸、维生素和微量元素。鱼类作为高蛋白、低热量的食物，是一种比家禽、家畜都要优越的动物性食物［3］。

1 鱼类遗传多样性的研究技术

随着生物学研究层次的提高和实验手段的不断改进，检测鱼类遗传结构及多样性的方法得到了迅速发展，从形态学水平(表型水平)、细胞学(染色体)水平、生理生化(蛋白质)水平发展到目前的分子水平。

1.1 鱼类形态学水平的研究

鱼类的形态学标记是以鱼的外部形态特征来检测遗传多样性的技术，分为传统的形态学分析和“框架法”多度量形态学分析。传统的形态学研究分两类：(1)可量性状分析：鱼体各部分的测量值如全长、体长、体高等信息。(2)可数性状分析：诸如脊椎骨、鳍条、侧鳞线等的数目。通过对可量性状和可数性状的数据在不同群体间进行逐对比较，分析鱼类群体间的形态差异［4］。“框架法”比传统的形态学分析方法在反映鱼类形态差异方面更为有效，它是通过测量鱼体外形轮廓若干特点间的间距，采用多元分析来描述鱼的外部轮廓特征。刘建勇等［5］对我国沿海不同地理的鲻鱼用聚类分析和判别分析及主成份分析的方法进行了变量分析。李思发等［6］对红鲤四个品系(兴国红鲤、玻璃红鲤、荷包红鲤、及瓯江彩鲤)的形态差异和种系关系进行分析，认为把可量性数据和框架测定数据结合在一起，使用多元变量分析技术，可增强鱼类种内不同群体间差异和亲缘关系的研究。

1.2 鱼类细胞学水平的研究

显微镜技术的发展，使人们建立了通过染色体和带型分析技术来鉴别客观物种分类和核型演化，主要是染色体核型，包括染色体数目、大小、随体、着丝点位置和带型(C带、G带和N带等)，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性来揭示鱼类的遗传变异情况［7］。周伯春［8］等对我国海产的条石鲷、金钱鱼、星斑裸颊鲷注射植物血球凝集素和秋水仙素进行核型制片，用以研究三种鱼类种属间的亲缘关系。钟声平［9］等采用PHA体内注射法制备了我国七带石斑鱼头肾组织染色体标本并进行了核型分析，探讨七带石斑鱼的演化地位。

1.3 鱼类蛋白质水平的研究

鱼类蛋白质水平的研究是以基因表达的直接产物蛋白质为遗传标记，而同工酶所指的是来源相同、催化同一化学反应而蛋白质分子结构、组成不相同的一类酶。根据同工酶结构中氨基酸序列或组成的不同，在电泳时的迁移率不同来揭示鱼类的遗传变异［10］。孟彦［11］等对采自湖北荆州的月鳢和乌鳢6个组织中的乳酸脱氢酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)进行了分析，研究了两者的生化遗传特性和遗传差异。李敏［12］等对贵州的5种野生鱼的肝、肾组织中的EST同工酶进行了研究，并以酶谱为性状结合数值分类法计算了EST同工酶的联合系数，分析了5种鱼之间的亲缘关系。

1.4 鱼类DNA分子水平的研究

1.4.1 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)

RFLP 技术由 Bostein(1980)［13］首次提出。该技术是由限制性酶切位点的插入、缺失、重排或点突变所引起的基因型间限制片段长度差异这一概念作为一种分子标记用于遗传作图。由于RFLP技术分析所需的DNA量比较大，而且检测步骤多，检测时要用到放射性同位素等因素限制了RFLP技术的使用范围。使得分子量较小、容易纯化的DNA样品如线粒体DNA、叶绿体DNA、PCR扩增产物的RFLP分析得到了发展和应用。张敏莹［14］等对我国长江下游铜鱼线粒体DNA的控制区(D-loop区)和细胞色素b(Cytb)遗传多样性进行了PCR-RFLP分析，发现铜鱼线粒体DNA遗传多样性较低。王淞［15］等对湖北监利、江西瑞昌、湖南长沙3个长江野生鲢和天津宁河1个人工繁殖群体进行了mtDNA D-loop区段的RFLP分析，发现只有宁河人工繁殖群体的多样性指数最高。

1.4.2 微卫星DNA(Microsatellite DNA)

微卫星(Microsatellite)又称简单序列(simple sequence repeat，SSR)，重复 DNA 是由 1—6 个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，在染色体上呈随机分布，由于重复次数不同及重复程度不同而造成了每个座位的多态性。微卫星中最常见的是两个核苷酸的重复单位，如(AT)n［16］。

微卫星标记以其多态性丰富、稳定性和可靠性倍受关注，在水生生物的种群遗传多样性分析中得到了广泛的使用。史方［17］等使用微卫星标记评估了我国乌江彭水水电站对泉水鱼的影响。研究表明水电站建成后造成了阻隔，对生态环境的连通性及坝上坝下鱼类的交流产生了不利，影响了物种的遗传多样性。全迎春［18］等应用微卫星对东北大口鲇的2个群体进行了多态性分析，完成了该鱼种的种群遗传分析。

1.4.3 随机扩增多态性 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)

RAPD 技术是由 Williams(1990)［19］和 Welsh(1990)［20］两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态性检测技术，其原理是采用随机合成的较短的单个随机引物对基因组DNA进行PCR扩增。孟立霞［21］等运用RAPD的技术对四川雅砻江流域的2属5种(亚种)裂腹鱼类的亲缘关系进行分析，得到了和形态学研究一致的结果。孟彦羽［22］等运用RAPD对采自海南、浙江、江苏和河北等近海海域的4个地理群体银鲳进行了遗传多样性分析，结果发现江苏群体的遗传多样性最高，而海南的银鲳群体多样性较低。

1.4.4 内部简单重复序列(Inter Simple Sequence Repeats，ISSR)

ISSR技术的基本原理就是在SSR的3’或5’端加锚1—4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置来分析不同样品间ISSR标记的多态性［23］。吴兴兵［24］等使用ISSR技术对我国的青鱼、草鱼、鲢、鳙、团头鲂、翘嘴红鲌和鳜7个经济鱼类进行了遗传多样性分析。韩晓磊［25］等对我国长江苏州段的野生鳡鱼、赤眼鳟和草鱼进行了简单重复序列区间扩增的遗传分析，发现三种鱼在形态分类在属上是同一水平，且鳡鱼和草鱼的亲缘关系较近。

1.4.5 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)

AFLP技术是由荷兰Keygene公司科学家Zebeau Marc(1993)发明创建的一种DNA分子标记新技术［26］，它不仅具备了其它DNA分子标记技术所具有的特点，多态性丰富，共显性表达，不受环境影响，无复等位效应，而且还具有带纹丰富，用样量小，灵敏度高，快速高效等特殊优点。佟广香等［27］对我国野生哲罗鱼种质资源遗传多样性的AFLP分析发现哲罗鱼资源减少影响了其种群的遗传多样性，应采取及时有效的措施对野生哲罗鱼资源进行保护。

1.4.6 DNA测序分析及单核苷酸多态性分析技术

DNA序列测定是直接从遗传物质DNA的核苷酸组成上检测遗传变异，分析对象可分为线粒体DNA和核DNA两种，它能提供基因组特异区域的完全的遗传信息。核DNA受到人们关注的是核糖体DNA，对于真核生物的研究主要为ITS区域［28］。鱼类线粒体DNA的研究区域主要为细胞色素b(Cytb)区域、3个细胞色素c(Cytc)氧化酶的亚单位(COⅠ、Ⅱ、Ⅲ)区域和线粒体控制区(D-环区)［29］。

2 鱼类遗传多样性的研究进展

各类遗传多样性研究技术在鱼类研究中取得了很大的进展。在种群遗传结构和亲缘关系分析方面：牟希东［30］等用RAPD对金鱼的5品系草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿的遗传多样性和亲缘关系进行了研究;马春艳［31］以中国近海的5属11种的鳀科鱼类为研究对象，分析其线粒体16SrRNA片段，探讨了中国鳀科鱼类的亲缘关系。在系统发育方面：马春艳［32］等对中国沿海鲳属的银鲳、中国鲳、翎鲳的mtDNA的细胞色素b基因片段进行了PCR扩增，分析了鲳属鱼类的系统进化及亲缘关系;吕凤义［33］等对我国4种鲿科鱼类的mtDNA的控制区进行PCR扩增，通过遗传距离和系统分析了亲缘关系;梁日深［34］对我国石鲈科的4属10种鱼类的S7核糖体蛋白基因内含子1部分序列特征，采用MP法和NJ法构建系统发育树分析其亲缘关系。在种质鉴定方面：张平［35］等提出运用RAPD-SCAR在鱼类可以使种质鉴定更准确高效，缩短鱼类的育种周期;夏军红［36］对细胞色素b进行PCR扩增，进行了鲷科鱼类的种类鉴定分析。在遗传图谱构建和遗传育种方面：张研［37］运用微卫星技术、RAPD技术和AFLP技术对我国的鲤鱼进行了分子标记研究并构建了鲤鱼的遗传连锁图谱，为培育出生长快、抗病强、适应集约化的鲤鱼提供了理论依据。

3 结束语

上述的各种研究方法并不相互排斥，都能提供许多有价值的信息，因此，对几种研究方法结合运用，能为遗传多样性研究提供更为充分而全面的信息。而这些技术在鱼类的遗传学研究、保护生物学、渔业资源管理方面有着广阔前景。

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Research techniques and progress of fish genetic diversity in China

XIANG Wen-dian，LIN-Jia
(School of biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

With the development of research methods and experimental techniques，the research of fish genetic diversity has developed from morphological，cytological，biochemcial level to DNA molecular level.This review summarized the research progress on fish genetic markers and the current situation of application.

fish;genetic diversity;research methods;

Q 14

A

1009-4881(2011)03-0029-05

10.3969/j.issn.1009-4881.2011.03.008

2011-03-08.

向文殿(1986-)，男，硕士研究生，E-mail：xiangwend@163.com.