头痛宁对偏头痛模型大鼠硬脑膜、三叉神经节及脑干区JNK-1和PAR-2表达的影响

方 莉,白金娟,连亚军#,徐会茹,顾 盼

1)郑州大学医院检验科郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院神经内科郑州 450052

#通讯作者,女,1964年4月生,博士,主任医师,研究方向:头疼和癫痫,E-mail:lianyajun369@sina.com

近年来疼痛中枢敏感化在偏头痛发病机制的研究中被越来越多提及[1],研究[2]表明中枢敏感化的发生发展与细胞信号转导存在密切联系。丝裂原活化蛋白激酶家族c-Jun氨基末端激酶-1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK-1)可对多种细胞外刺激发生反应而调节细胞信号,JNK-1在短暂缺血后线粒体依赖的凋亡过程中起着关键作用。G-蛋白耦联受体家族蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2, PAR-2)活化后引起信号级联反应,参与炎症、疼痛与修复等许多病理生理过程,其在神经系统也有较高表达[3-4]。据报道[5]由当归、天麻等组成的中药头痛宁对偏头痛的防治效果良好,具有绿色镇痛和无药物依赖性的优点,药效学实验证明有镇静、镇痛和解痉作用,但其分子水平作用机制尚不明确。该研究采用硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型,观察头痛宁干预前后大鼠硬脑膜、三叉神经节及脑干区JNK-1和PAR-2的表达,探究偏头痛发病机制及头痛宁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及药品 SD大鼠 30只,雌雄各半,体质量 250～300 g,由河南省实验动物中心提供。兔抗大鼠JNK-1和PAR-2多克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品),山羊抗兔二抗、SP-9001免疫组化染色试剂盒和DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司),头痛宁(咸阳步长制药有限公司),硝酸甘油注射液(北京益民药业有限公司)。

1.2 动物分组及处理 采用随机数字表法将30只大鼠分为正常对照组、模型组和头痛宁治疗组,每组10只。正常对照组大鼠皮下(前额、双颞部)注射生理盐水1.04 m L/kg。模型组和治疗组大鼠皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg,建立实验性偏头痛模型,以动物出现双耳发红、前肢频繁挠头和爬笼次数增多等头部不适症状为造模成功。模型组造模 30 min后灌胃蒸馏水1.04 mL/kg,治疗组造模15～20 min后灌胃头痛宁1.2 g/kg,1次/d,共1周。

1.3 脑组织中JNK-1和PAR-2表达的免疫组化检测 1周后,用体积分数为10%水合氯醛(3.5 m L/kg)腹腔注射麻醉,灌注后在硬脑膜、三叉神经节和脑干区 3个部位取材,连续冠状面切片,每片厚约4μm。采用SABC法进行免疫组化染色,JNK-1和PAR-2一抗工作浓度均为1∶200,以PBS取代一抗作为阴性对照。切片背景为淡黄或无色,阳性细胞呈黄棕色,多为圆形或卵圆形,可聚集成线状、颗粒样、条块状或零星散在。采用病理图像分析系统,所有切片在同一强度、同一放大倍数下进行观察, JNK-1及PAR-2阳性反应的标记强度用平均积分光密度表示。每张切片选取 5个视野,取其平均值进行比较。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析,对3组JNK-1及PAR-2蛋白积分光密度值行正态性和方差齐性检验,数据均呈正态分布且方差齐,再用单因素方差分析和SNK-q检验比较3组大鼠大脑不同部位JNK-1和PAR-2积分光密度值,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学变化 模型组和治疗组给予硝酸甘油5～10min后开始出现前肢频繁挠头动作及爬笼现象,30～60 m in后 2组挠头次数及爬笼次数增多。模型组上述表现在 120 min后开始减少, 180min时全部消失。治疗组上述现象于 60～120 min后逐渐减少至全部消失。

2.2 各组大鼠大脑不同部位JNK-1和PAR-2的表达 模型组大鼠硬脑膜、三叉神经节和脑干区均可见JNK-1和PAR-2阳性神经元,但以硬脑膜区棕黄色阳性反应颗粒最大最密集,其次为三叉神经节区、脑干区(图 1和表 1)。对照组和治疗组大鼠上述各部位JNK-1和PAR-2的分布特征与模型组相同,但均低于模型组,对照组和治疗组各部位JNK-1和PAR-2的表达差异无统计学意义。

图1 各组大鼠硬脑膜、三叉神经节和脑干区JNK-1及PAR-2的表达上:硬脑膜组织;中:三叉神经节组织:下:脑干区。A:对照组;B:模型组;C:治疗组。1:JNK-1;2:PAR-2。

表1 各组大鼠大脑不同部位JNK-1和PAR-2积分光密度比较

3 讨论

研究[4]发现 PAR-2广泛表达于脑组织及外周神经系统,其活化与神经源性炎症、疼痛和痛觉过敏有关,但具体作用机制不明。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶(PAK),在胞质信号转导中起重要作用[6]。在哺乳动物中MAPK家族主要有3种:细胞外信号调节蛋白激酶(ERKs),JNK/SAPK和p38 MAPK。研究[7]表明MAPK在疼痛中枢敏感化的形成和发展中可能起重要作用。外界刺激可通过Ras依赖或非Ras依赖两条途径激活JNK,小分子G蛋白Ras超家族的成员之一Rho可能也是JNK激活的上游信号[8],Rho蛋白Rac及cdc42的作用可能是与p21激活的PAK结合,使其自身磷酸化而被激活,而活化的 PAK进一步使JNK激活[9],经一系列反应使核内c-Jun磷酸化,进而激活c-Jun而增强其转录活性[10],促进c-Jun/c-Fos异二聚体及c-Jun同二聚体的形成,也可结合于基因启动子位点,增加特定基因的转录活性及转录因子活性等,引起大量与凋亡有关的基因表达,与细胞延迟性死亡关系密切[11]。JNK信号途径也参与许多病理过程[12]。当三叉神经受到外界理化因素刺激时JNK表达增多,并引起一系列链式反应,最终引起组蛋白乙酰化,这均可使三叉神经对周围刺激的敏感性提高[13]。

以上两类受体活化都可将胞外的信息传递到胞内,并通过调节基因表达,使中枢可塑,由此一些学者认为其活化表达可能参与偏头痛发作,但相关的动物实验研究却并不多见。

作者的研究结果显示,模型组JNK-1及PAR-2在硬脑膜、三叉神经节及脑干区的表达均上调,用头痛宁治疗后二者的表达下调,提示JNK-1和PAR-2参与了偏头痛的发生;中药头痛宁作用可能的机制是通过拮抗G蛋白偶联受体来抑制信号传导,从而起到防治偏头痛的作用。

[1]WilliasWD,Coggeshall RE.Sensory mechanisms of the spinal cord[M].Kluwer New York:Cademic/Plenum Press,2004.

[2]秦晓辉,张宏.病理性疼痛中枢敏感化细胞内的信号传导[J].中国临床康复,2005,9(17):145

[3]刘辉,贾庆军,郭魁亮.蛋白酶激活受体-2在中枢神经系统的双重作用[J].生命的化学,2008,28(4):223

[4]牛青霞.何韶衡.蛋白酶活化受体-2的研究进展[J].生理科学进展,2003,34(4):373

[5]张秀玲.头痛宁胶囊治疗偏头痛 120例临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(7):814

[6]Crosio C,Heitz E,Allis CD,et al.Chromatin remodeling and neuronal response:multiple signaling pathways induce specific histone H 3modiflcations and early gene expression in hippocampal neurons[J].JCell Sci,2003,116(Pt 24):4905

[7]Ji RR,Gereau RW 4th,Malcangio M,et al.MAP kinase and pain[J].Brain Res Rev,2009,60(1):135

[8]Minden A,Lin A,Claret FX,et al.Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptionalactivity by the small GTPasesRac and Cdc42Hs[J].Cell,1995, 81(7):1147

[9]Minden A,Lin A,McMahon M,et al.Differential activation of ERK and JNK mitogen-activated protein kinase by Raf-1 and MEKK[J].Science,1994,266(5191):1719

[10]Minden A,Lin A,Smeal T,et al.c-Jun N-term inal phosphorylation correlates with activation of the JNK subgroup but not the ERK subgroup ofm itogen-activated protein kinase[J].Mol Cell Biol,1994,14(10):6683

[11]Johnson GL,Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathwaysmediated by ERK,JNK,and p 38 protein kinases [J].Science,2002,298(5600):1911

[12]Bennett BL,SasakiDT,Murray BW,et al.SP600125,an anthrapyrazolone inhibitor of Jun N-term inal kinase[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(24):13681

[13]Wu J,Zhang X,Nauta HJ,etal.JNK 1 regulates histone acetylation in trigeminal neurons following chemical stimu lation [J].Biochem Biophys Res Commun,2008,376(4):781