硫化氢抑制小胶质细胞内β-淀粉蛋白的毒性作用

硫化氢（H2S）作为内源性气体信号分子，对阿尔茨海默病（AD）病理过程的影响尚不清楚。AD是最常见的神经变性疾病，以胞外β淀粉蛋白（Aβ）沉积物积聚和脑内大量神经原纤维缠结为特征。目前认为Aβ的可溶性聚集物可能在AD发病机制中起关键作用。已有实验证实，小胶质细胞的激活可能在Aβ沉积和神经元变性之间起关联作用。小胶质细胞的活化可以产生并释放某些促炎症因子，表明小胶质细胞活化在AD中具有重要作用。因此，H2S是否在Aβ激活小胶质细胞的过程中发挥作用值得探讨。

本实验以BV-2细胞和原代培养的小胶质细胞为研究对象。处理组细胞用β淀粉样多肽（Aβ1-40）孵育24 h；预处理+ Aβ1-40组的细胞分别用不同浓度的硫氢化钠（NaHS，H2S的外源性供体）溶液、S-腺苷蛋氨酸（SAM）、SB203580（p38抑制剂，1 μmol/L）、JNK抑制因子Ⅱ（JNK抑制剂，50 μmol/L）预处理30 min，而后与Aβ1-40（25 μmol/L）共孵育24 h。噻唑蓝（MTT）还原测定结果表明，Aβ1-40可明显抑制BV-2细胞的MTT生成，而NaHS在25～500 μmol/L范围内可呈浓度依赖性减弱Aβ1-40的这种抑制效应。200 μmol/L NaHS的抑制效应最显著，说明H2S具有抗Aβ1-40损伤的细胞保护作用。Aβ1-40处理后，BV-2细胞内乳酸脱氢酶（LDH）的活性可提高56.4%。该效应可明显被200～500 μmol/L的NaHS抑制，提示H2S可通过降低细胞膜通透性保护Aβ1-40引起的细胞损伤。生长抑制DNA损伤蛋白（GADD153）的功能是阻断细胞周期由G1期进入S期。蛋白免疫印记分析显示，用Aβ1-40处理细胞24 h后，GADD153的表达量是未处理前的1.9倍。这种上调效应可被50～100 μmol/L的NaHS预处理减弱，提示Aβ能抑制细胞周期再循环，而H2S可对抗此作用。用2 μmol/L的Aβ1-40处理BV-2细胞24 h能明显刺激NO的生成。50～500 μmol/L的NaHS可呈浓度依赖性抑制Aβ1-40的促NO生成效应。且500 μmol/L的NaHS抑制效应最显著。胱硫醚-β-合成酶（CBS）是胶质细胞内生成H2S的主要酶。笔者使用CBS的激动剂—SAM来验证内源性H2S的作用。实验发现NaHS（100 μmol/L）和SAM（100 μmol/L）均有抑制NO生成的效应。Aβ上调BV-2细胞内诱导型NOS（iNOS）的表达。这种上调效应可被NaHS（100 μmol/L）或SAM（100 μmol/L）减弱。提示H2S可通过抑制Aβ的促iNOS表达作用而发挥抗炎效应。Aβ能明显促进BV-2细胞内肿瘤坏死因子（TNF）-α的生成。外源性NaHS可浓度依赖性抑制Aβ的促TNF-α生成效应。BV-2细胞经Aβ处理不同时间后发现，15 min时Aβ开始促进丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）磷酸化，2 h达高峰，直到处理细胞24 h，Aβ仍有促进磷酸化效应。100～500 μmol/L的NaHS可明显降低由Aβ所致的p38 MAPK活性。Aβ作用于BV-2细胞15 min时即可诱导JNK蛋白激酶磷酸化，随即达高峰并持续在高磷酸化状态。100～500 μmol/L的NaHS可明显降低由Aβ所致的JNK活性。Aβ作用1 h后能明显促进ERK活性，此后至作用6 h，活性逐渐降低。至用作24 h，ERK活性恢复正常。用100～500 μmol/L的NaHS预处理30 min不影响Aβ作用1 h后的ERK磷酸化水平。表明H2S的细胞保护作用与抑制JNK和p38活性有关，而与ERK无关。环氧化酶（COX）-2是类前列腺素形成的重要生物调节剂。本研究发现Aβ能显著上调COX-2。这种上调效应可被H2S抑制。表明H2S可通过抑制Aβ促类前列腺素生成的抗炎效应来发挥细胞保护功能。

总之，无论是BV-2细胞还是原代培养的小胶质细胞，H2S均可降低BV-2细胞内Aβ的细胞毒性，减少GADD153的表达，抑制小胶质细胞内Aβ诱导的NO和TNF-α表达，减少Aβ上调蛋白COX-2的表达，降低Aβ诱导的p38/JNK MAPKs活性。综上，H2S具有治疗神经退行性疾病的潜在价值。

（李战永摘 杨卓审校 译自JAlzheimersDis,2010,22:1189-1200）